【摘要】：来曲唑(letrozole)是人工合成的苄三唑类衍生物,其可以抑制细胞色素P450芳香酶的活性,从而导致机体内雌激素水平的下降,一般用于乳腺癌的化疗和放疗。阿特拉津(atrazine)又名莠去津,属三氮苯类除草剂,主要用于林果地和玉米田中一年生杂草的防治。近年来,有许多报道在城市污水、地表径流、河流和湖泊中检测到了来曲唑和阿特拉津的存在。由于来曲唑和阿特拉津不易降解,残效期长和具有内分泌干扰作用的特点,其对水生环境和人类的健康已经构成了潜在的威胁。为进一步了解它们影响鱼类繁殖和鱼类性别鱼类的内分泌干扰机制,本研究采用组织学和分子生物学方法来研究不同浓度的来曲唑(25μg/L,125μg/L,625μg/L)和阿特拉津(26.80μg/L,268μg/L,2680μg/L)暴露成年泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)7天,14天,21天后,雌性和雄性泥鳅性腺组织学变化,性别分化相关基因表达的变化。并通过利用高通量测序技术建立正常泥鳅和来曲唑以及阿特拉津处理后泥鳅的精巢、卵巢miRNA表达谱,初步探讨来曲唑和阿特拉津处理下miRNA对泥鳅性腺发育和分化的影响。来曲唑处理结果显示:与对照组相比,625μg/L来曲唑处理的雌鱼初级卵母细胞的数量显著减少;雄鱼出现生精小管管腔扩张和精子数量的增加。六个性别发育和分化相关基因的mRNA表达水平,包括sox9a(sry-related HMG box-9a),sox9b(sry-related HMG box-9b),sf1(steroidogenic factor-1),dmrt1(double sex and mab-3 related transcription factor1)和amh(anti-Mullerian hormone)在精巢或卵巢中上调,但在两性的大脑中没有发生变化或者降低,除了ar(androgen receptor)表现出相反的表达模式。其他四个基因cyp19a(cytochrome P450 19a),foxl2(winged helix/forkhead transcription factor2),erα(estrogen receptorα)和erβ(estrogen receptorβ)在大脑和性腺中的表达则表现出浓度依赖性并具有性别和组织特异性。阿特拉津处理首先确定了阿特拉津对泥鳅的急性毒性,在此基础上进行暴露实验。实验结果表明:阿特拉津对泥鳅的24h、48h、96h的半数致死浓度(LC50)分别为31.60mg/L、26.82mg/L、18.98mg/L,安全质量浓度(SC)为5.8mg/L。随着阿特拉津浓度的升高和处理时间的增长,泥鳅的死亡率出现明显的上升。通过组织学研究发现高浓度的阿特拉津(2680μg/L)能够抑制泥鳅精巢精子的发生,促进卵巢细胞的发育。同时qRT-PCR结果显示:与对照组相比不同剂量的阿特拉津能够显著的促进cyp19a,foxl2,erβ,sf1等基因的表达,而erα表现出相反的表达模式。对sox9a,sox9b,dmrt1和amh具有显著的抑制效应。利用高通量测序技术分别建立了成熟泥鳅正常精巢和卵巢以及来曲唑、阿特拉津分别处理8h、24h的精巢和卵巢小RNA文库,测序结果表明:泥鳅性腺中绝大多数短序列小RNA,长度集中在27-28bp,推测泥鳅性腺中存在大量的piRNA。利用加尾法设计引物,对两个对比组(DC-S24hAC和DX-S24hLX)中随机选取的表达具有显著差异的两个已知的泥鳅miRNA和两个新预测的泥鳅miRNA(miR-138-x,miR-335-x,novel-m0694-5p,novel-m0301-3p;miR-130-x,miR-205-x,novel-m0279-5p,novel-m0333-5p)进行荧光定量PCR验证,结果与测序结果一致,说明通过高通量测序获得的mi RNA表达谱数据是可信的。利用三个靶基因预测软件对全部1442个miRNAs进行靶基因预测,预测到共有143549个靶基因对应6415895个靶基因位点。在对靶基因预测结果分析中,我们预测得到了与性别相关的几个基因(foxl2,erα,erβ,ar,dmrt3,cyp17等)。通过分析每个基因所对应的miRNAs,结合样品间差异表达miRNAs的数据结果,我们发现一些miRNAs(mi R-181-y,let-7-x,miR-132-y等等)可能在鱼类的性腺中发挥一定的作用。对这些样品间差异表达miRNA的靶基因做了GO功能注释后,发现各个组间差异表达miRNA作用的靶基因功能基本一致,都涉及到细胞发生,信号传导,细胞膜及细胞膜组成,分子的结合,催化和转录等过程。
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【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X592;S917.4
【参考文献】
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