单细胞、显微计数和高通量测序典型水稻土微生物组的技术比较

发布时间：2019-08-01 09:23

【摘要】：【目的】比较传统显微计数、单细胞分选和现代分子方法研究典型水稻土微生物组的细胞数量、物种组成及好氧甲烷氧化菌生理生态过程的技术特点。【方法】针对水稻土中可提取微生物细胞(土壤细胞)及其DNA(细胞DNA)、单细胞DNA、土壤微生物组总DNA(土壤DNA),利用传统显微计数和实时荧光定量PCR(qPCR)方法,研究水稻土好氧甲烷氧化过程中微生物数量的变化规律;通过高通量测序16S rRNA基因技术,研究微生物物种组成的变化规律。【结果】水稻土微生物组的传统显微计数结果显著低于现代分子方法 qPCR,最高可达3个数量级。基于DAPI染色、CARD-FISH、细胞DNA及土壤DNA的qPCR定量结果分别为:(5.8 7.4)×10~7、(1.7 1.9)×10~7、(2.8 6.3)×10~8、(1.5 2.7)×10~(10) cells/g。基于qPCR的水稻土好氧甲烷氧化菌数量为1.1×10~7 cells/g,比传统显微计数方法高3个数量级。然而,当水稻土氧化高浓度甲烷后,所有方法均发现甲烷氧化菌显著增加,增幅分别为54倍(CARD-FISH)、388倍(细胞DNA)和45倍(土壤DNA)。在微生物分类学门的水平,细胞DNA(25个门)与土壤DNA(30个门)结果基本一致,均能较好地反映水稻土微生物组的群落结构,而单细胞DNA尽管检测到20个门,但偏好性较大,95%以上均为Proteobacteria。在微生物分类学属的水平,土壤DNA、细胞DNA和单细胞DNA分析均表明背景土壤含有7个好氧甲烷氧化菌的pmo A基因型,但氧化高浓度甲烷后,γ-Proteobacteria的2个属Methylobacter/Methylosarcina则成为优势类群。【结论】土壤微生物的传统显微计数(DAPI和CARD-FISH)结果显著低于qPCR技术,相差1 3个数量级。qPCR定量土壤DNA和细胞DNA表明:水稻土可提取微生物细胞约占土壤微生物总量的2%左右,而好氧甲烷氧化菌的提取效率最高可达6%。细胞DNA在门水平能较好地反映水稻土微生物组成,但在属水平和土壤DNA有着较大差异。Planctomycetes微生物门的细胞易被提取,Acidobacteria门的微生物则较难被提取,而单细胞分选技术则偏好Proteobacteria。尽管传统方法和分子技术的分辨率明显不同,但均能较好地表征水稻土甲烷氧化的微生物生理生态过程。未来土壤微生物组研究应更加重视科学问题本身对技术手段的内在需求,最大限度发挥各种先进技术的优势。
【图文】：

5%，总有机碳15g/kg，总氮1.59g/kg，总磷1.23g/kg，pH7.4(水土比2.5)[13]。1.1.2实验技术路线：如图1所示，每个土壤可获得4种不同的样品：直接提取的土壤微生物细胞(土壤细胞)、从土壤细胞悬液进一步提取的细胞DNA(细胞DNA)、从土壤细胞悬液经单细胞分选及全基因组扩增后获得的DNA(单细胞DNA)和直接提取的土壤微生物总DNA(土壤DNA)。(1)针对水稻土微生物组的数量：采用DAPI染色和CARD-FISH杂交两种显微计数方法，分析土壤细胞数量；采用qPCR分子技术分析细胞DNA和土壤DNA中微生物基因数量。(2)针对水稻土微生图1.实验整体思路和技术流程Figure1.Flowdiagramofthestudy.物的物种组成：采用高通量测序16SrRNA和pmoA基因的方法，分析土壤DNA、细胞DNA、单细胞DNA中的微生物组成。水稻土样品则来自高浓度甲烷氧化前后，即零时刻的背景土壤(Day0)和氧化了600μmol甲烷的水稻土(Day-17)。最后比较传统显微计数、现代分子方法研究土壤微生物组的数量、组成及好氧甲烷氧化微生物生理生态过程的技术特点。1.1.3水稻土好氧甲烷氧化微生物过程：调整土壤含水量至最大持水量的60%(实际含水量33%)，在无菌封口袋中充分混匀后，28°C预培养4d，使土壤微生物充分活化。取8g作为0时刻样品(Day0)， 20°C保存用于总DNA及土壤细胞的提龋其余土样用于微宇宙培养。在120mL血清瓶中加入8g水稻土，，设置3个平行，用丁基橡胶塞密封后用铝盖封口，抽真空后，用注射器注入14.4mLCH4，36mLO2，并用N2补充至1个大气压，甲烷初始浓度约85.7g/m3，28°C避光培养。前10d每天监测1次CH4浓度，10d后每3 4d监测1次。待瓶内甲烷浓度降至7.14g/m3以下(第17天)终止实验，取出土壤保存于 20°C用于总DNA及土壤细胞的提龋培养

单细胞、显微计数和高通量测序典型水稻土微生物组的技术比较

贾仲君等|微生物学报,2017,57(6)907http://journals.im.ac.cn/actamicrocn图2.水稻土氧化甲烷的动力学过程(A)及土壤总微生物(B)与甲烷氧化菌(C)的数量变化Figure2.Consumptiondynamicsofmethanebypaddysoil(A),copynumberchangesof16SrRNA(B)andpmoAgenes(C)in1gwetweightsoil(wws)orincellsexractedfrom1gwetweightsoilbeforeandaftermethaneincubation.Errorbarsrepresentstandarddeviations(n=3),andcolumnswiththedifferentlettersaresignificantlydifferent(P<0.05)byone-wayANOVA.2.3基于DAPI染色和CARD-FISH杂交的土壤微生物组及甲烷氧化菌数量比较通过DAPI染色及CARD-FISH计数对土壤可提取微生物细胞计数。如图3-A所示，Day0样本中总微生物细胞的DAPI计数为5.8×107cells/g，Day17样本中略微增加至7.4×107cells/g。而CARD-FISH的计数结果分别为1.7×107cells/g(Day0)和1.9×107cells/g(Day17)(图3-B)。DAPI染色的灵敏度更高，是CARD-FISH计数结果的3 4倍。利用TypeI和TypeII甲烷氧化菌的特异探针进行CARD-FISH计数，结果表明高浓度甲烷氧化过程中，好氧甲烷氧化菌的数量显著增加(图3-C，D)。零时刻甲烷氧化菌数量较低，TypeI甲烷氧化菌约1.6×104cells/g，TypeII甲烷氧化菌约2.1×104cells/g；而高浓度甲烷培养后(Day17)，两类甲烷氧化菌数量均显著增加(t-test，P<0.01)，TypeI甲烷氧化菌数量增加至1.7×106cells/g，增加100倍左右(图3-C)。TypeII甲烷氧化菌增加到4.1×104cells/g，增加1倍左右(图3-D)。Day0水稻土中甲烷氧化菌总量约3.7×104cells/g；Day17则增加至1.7×106cells/g，增幅约45倍。2.4基于高通量测序的土壤微生物组成分析在微生物分类学门的水平，高通量测序
【作者单位】：中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室;中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室;
【基金】：中国科学院战略性先导科技专项(B类)项目(XDB15040000) 国家自然科学基金青年基金(41401294)~~
【分类号】：S154.3

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