多粘类芽孢杆菌SC2发酵条件优化及抑菌物质的分离纯化

发布时间：2020-04-05 06:35

【摘要】：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类对植物生长有明显促进作用的植物根际促生菌(Plant-growth-promoting rhizobacteria,PGPR),现已广泛应用于农业生产中。多粘类芽孢杆菌SC2分离自辣椒根际,本文对多粘类芽孢杆菌SC2抗细菌活性物质的发酵条件及其培养基配方进行了优化,并对抗细菌活性物质进行了分离纯化,主要内容如下:以阿须贝培养基为基础培养基,通过单因子试验确定了最佳碳源、氮源、以及添加金属离子对抗菌物质产量的影响。通过正交设计,响应面分析,确定抑菌率最大时的最优培养基。最后最适的发酵温度。结果表明蔗糖、硫酸铵为最佳碳氮源。除镁离子外,锰离子、锌离子对多粘类芽孢杆菌SC2胞外抗菌物质的产生均具有抑制作用,最终,确定SC2的最佳发酵培养基配方为蔗糖43.60g/L、(NH_4)_2SO_4 6.66g/L、CaCO_3 6.26g/L、MgSO_4 0.2g/L、KH_2PO_4 0.2g/L、NaCl 0.2g/L,最佳发酵温度为37℃、培养时间为60h。抗菌物质的最终产量提高了大约4倍。为了获得发酵液中较纯的抗菌物质并对其进行鉴定,本研究对其进行了分离纯化。研究主要采用的方法包括萃取得到棕色粗提物,进行高效液相色谱(HPLC)分析。通过分析型HPLC分析,共发现了7个活性峰,保留时间分别为:5.5min、7.5min、9min、12.5min、16min、17.5min、23.5min。对7个活性峰收集并进行质谱分析,确定了多粘类芽孢杆菌SC2产生的代谢产物中除多粘菌素P1、多粘菌素P2外还有五个未知的抗菌活性物质。通过制备型HPLC分析,共发现5个活性峰,保留时间为11.1min、25.1min、27.8min、33.8min、34.9min。将各活性峰收集、浓缩后进行二次液相分离,优化各峰洗脱条件,分离出抗菌活性物质。通过质谱分析技术,对活性物质的含量、分子量及结构进行了分析,结果显示:保留时间为11.1min的活性峰浓缩液经二次分离后得到两个纯度较高的活性峰。经过一级质谱分析确定其分子量分别为1190、1176,与多粘菌素P2、多粘菌素P1分子量相一致。经过二级质谱分析确定其结构分别与多粘菌素P2、多粘菌素P1结构相同。保留时间为34.9min的活性峰浓缩液经二次分离后得到两个活性峰,一级质谱分析确定其分子量分别为1230、1258,结构尚未明确。
【图文】：

多粘菌素A1分子结构式Fig.1StructureofpolymyxinA1

图 3-1 多粘类芽孢杆菌 SC2 的菌落形态及菌体形态（放大倍数：10×100）olony morphology and thallus morphology of Paenibacillus polymyxa SC2 (magnificati多粘类芽孢杆菌 SC2 的纯度，从甘油管活化菌株，37℃培养图 3-1，菌落呈乳白色，表面粘稠。革兰氏染色呈阳性，SC生抗逆性的椭圆形芽孢。源对抗菌物质产量的影响物质产量，取重复与平行的平均值，结果如图 3-2 所示。十有拮抗效果，且效果有明显差异。本实验中可溶性淀粉效果利于后期抗菌物质的分离纯化，故不选择可溶性淀粉。蔗糖且蔗糖在工业应用上更为经济实用，故在后期的实验中均采杯碟法检测不同碳源对发酵效价影响的效果图。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S182

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本文编号：2614677