辣椒疫霉效应因子RxLR129113与辣椒互作蛋白的筛选鉴定研究

发布时间：2020-04-26 05:02

【摘要】：辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一。辣椒疫霉有20余种寄主,主要侵染叶、果实和茎,引起软腐、倒伏,可减产50%以上,对农业生产、生态造成数百亿元经济损失。辣椒疫霉隶属卵菌门,通过外泌效应因子进入植物质外体或植物细胞破坏防御系统促进病原菌侵染定殖。研究辣椒疫霉效应因子与寄主的互作关系对于探究卵菌致病机制及寄主防卫机制有重要意义。生物信息学分析发现辣椒疫霉分泌357个RxLR类效应分子,目前对于致病疫霉及大豆疫霉的致病机制已初步了解,但对于辣椒疫霉效应因子与寄主的互作机制还缺乏研究。本研究以辣椒疫霉侵染时期上调表达的效应因子PcRxLR129113为研究对象,筛选并鉴定了与PcRxLR129113互作的寄主靶标蛋白,以期解析辣椒疫霉效应因子的致病机制。主要研究内容如下:1.通过农杆菌瞬时表达体系,对辣椒疫霉效应因子PcRxLR129113进行功能分析及亚细胞定位分析。在本氏烟上农杆菌瞬时表达PcRxLR129113,该效应因子能够抑制由INF1和Bax诱导的植物防卫反应。对PcRxLR129113进行亚细胞定位分析显示,PcRxLR129113定位于植物细胞质及细胞核。2.使用酵母双杂交(Y2H)筛选PcRxLR129113在辣椒内的靶标蛋白。首先,将公司构建完成的辣椒cDNA质粒文库成功转入酵母菌株Y187中。对酵母文库进行质量鉴定,鉴定结果为:滴度为1.13×10~6 CFU/mL,文库的库容量为1.7×10~7 CFU。其次,成功构建了PcRxLR129113的诱饵载体,对诱饵蛋白进行自激活检测和毒性检测均满足要求。诱饵蛋白PcRxLR129113与辣椒文库杂交后,检测HIS3、URA3、LacZ三个报告基因的表达,对疑似互作子进行测序。经分析验证,筛选出9个互作蛋白,分别为乙醛脱氢酶,亮氨酸拉链类转录因子TGA1,果糖二磷酸醛缩酶,V型质子泵,三磷酸甘油醛脱氢酶,叶绿素a,b结合蛋白,肌动蛋白解聚因子,铁氧还蛋白,应激蛋白。Y2H证明PcRxLR129113与乙醛脱氢酶、亮氨酸拉链类转录因子TGA1与互作。3.免疫共沉淀(co-IP)证明PcRxLR129113与乙醛脱氢酶互作。将植物表达重组载体PcRxLR129113、ALDH7在本氏烟叶片瞬时共表达48-60 h后提取叶片总蛋白进行co-IP,证明PcRxLR129113与乙醛脱氢酶在体内互作。4.双分子荧光互补(BiFC)证明PcRxLR129113分别与乙醛脱氢酶、亮氨酸拉链类转录因子TGA1互作。农杆菌瞬时表达48-60 h,通过共聚焦显微镜成像,证明PcRxLR129113分别与乙醛脱氢酶、亮氨酸拉链类转录因子TGA1互作。5.RxLRW1-3为PcRxLR129113关键功能域,通过Y2H、BiFC和co-IP证明与ALDH7互作;通过Y2H和BiFC证明RxLRW1-3与TGA1互作。筛选辣椒疫霉效应因子PcRxLR129113的宿主靶标蛋白,研究靶标蛋白在病菌侵染过程中如何调控植物的防卫反应,为深入探究效应因子PcRxLR129113的致病机制奠定基础,为开发植物广谱抗病性生物农药提供理论依据,为抗病性状改良提供新途径。
【图文】：

山东农业大学硕士学位论文株中入侵、增殖，即为效应因子触发的免疫在感病植株中，病原体逃避宿主 ETI，或通过效应效应因子触发的感病（effector-triggered susceptibi种机制完成，包括影响宿主转录、蛋白质活动、变，，基因缺失，或通过 Avr 基因的转录沉默。因此水平特异性变异提供了多种效应因子库，应对由力（Tao et al., 2003）。

辣椒疫霉菌效应分子 RxLR129113 与辣椒互作蛋白的筛选鉴定合，从而启动报告基因的转录（Auerbach et al., 2003）；（2）并相互作用进行分析，各种酵母双杂交系统均有其适用范围，因此表达体系以适应不同蛋白互作验证；（3）大量外源基因的表达可正常表达，存在假阴性。因此，蛋白质间的相互作用还需其他方靠性。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.44

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘丽;胡梁斌;王德德;陈健;薛延丰;石志琦;;肉桂醛对辣椒疫霉的抑制作用[J];江苏农业学报;2014年02期

2 牛晓磊,薛泉宏,涂璇,袁虎林;6株生防放线菌对辣椒疫霉的皿内拮抗研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2005年01期

3 谢丙炎,朱国仁;辣椒疫霉产毒共分离RAPD标记的研究[J];菌物系统;2000年01期

4 孙文秀,贾永键,秦乃花,张修国;土壤中辣椒疫霉分离方法的研究与量化测定[J];菌物研究;2004年02期

5 戚仁德;丁建成;顾江涛;高智谋;岳永德;;辣椒疫霉致病力分化的初步研究[J];植物保护学报;2002年02期

6 张子君,刘晓舟,张宏志,张春萍;辣椒疫霉产孢方法初探[J];辽宁农业科学;1996年05期

7 李萍;江涛;高智谋;戚仁德;汪涛;;辣椒疫霉(Phytophthora capsici)对辣椒的致病力分化研究[J];植物病理学报;2012年04期

8 刘惕若,肖淑琴,史风玉;辣椒疫霉菌毒素的致病性及其对辣椒组织的毒性研究[J];黑龙江八一农垦大学学报;2003年01期

9 陈小均;吴石平;谭清群;何海永;杨学辉;;贵州辣椒疫霉种群的组成与分布[J];贵州农业科学;2014年11期

10 杜蕙,温沛宏,吕和平;几种杀菌剂抑制辣椒疫霉孢子囊形成的室内测定结果[J];甘肃农业科技;1999年01期

相关会议论文 前10条

1 王为镇;李腾蛟;刘西莉;;外源甾醇对辣椒疫霉生长发育的作用[A];中国植物病理学会2017年学术年会论文集[C];2017年

2 李萍;高智谋;;辣椒疫霉致病力分化研究[A];中国植病、菌物学会杭州联合年会论文集[C];2008年

3 庞智黎;陈磊;覃兆海;刘西莉;;辣椒疫霉对丁吡吗啉的敏感性基线建立及其室内抗性风险评估[A];中国植物病理学会2011年学术年会论文集[C];2011年

4 李腾蛟;王为镇;刘西莉;;辣椒疫霉纤维素合酶基因功能研究[A];中国植物病理学会2019年学术年会论文集[C];2019年

5 兰成忠;李本金;陈庆河;翁启勇;;辣椒疫霉菌孢子囊产生方法研究[A];中国植物病理学会2011年学术年会论文集[C];2011年

6 王艺烨;卓新;潘广学;陈方新;张华建;潘月敏;高智谋;;辣椒疫霉对甲霜灵的抗性监测及诱变研究[A];中国植物病理学会2019年学术年会论文集[C];2019年

7 崔晓岚;毕扬;吴鹏飞;刘西莉;;辣椒疫霉对氟吗啉的室内抗药突变体筛选及部分生物学性状的测定[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年

8 卓新;王艺烨;刘冬;姜庆雨;潘月敏;张华建;陈方新;高智谋;;辣椒疫霉抗甲霜灵基因的分子标记研究[A];中国植物病理学会2019年学术年会论文集[C];2019年

9 方媛;彭钦;高翔;钟珊;刘西莉;;辣椒疫霉Sec4同源基因敲除及其功能初探[A];中国植物病理学会2019年学术年会论文集[C];2019年

10 李腾蛟;王为镇;崔僮珊;刘西莉;;辣椒疫霉纤维素合酶基因PcCesA1功能研究[A];中国植物病理学会2018年学术年会论文集[C];2018年

相关博士学位论文 前8条

1 孙文秀;辣椒疫霉（Phytophthora capsici）致病遗传变异、多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及表达特性研究[D];山东农业大学;2007年

2 胡健;中国辣椒疫霉的群体结构和遗传变异研究[D];中国农业大学;2014年

3 付丽;辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶裂解酶基因克隆及功能研究[D];山东农业大学;2012年

4 冯宝珍;辣椒疫霉（Phytophthora capsici）诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究[D];山东农业大学;2011年

5 贾永健;辣椒疫霉（Phytophthora capsici）5个果胶甲基酯酶基因克隆及pcpme1的功能研究[D];山东农业大学;2008年

6 刘进平;胡椒离体培养和抗瘟病无性系选育[D];华南热带农业大学;2003年

7 王会征;一种与聚羟基脂肪酸酯生物合成相关的新型水合酶结构生物学研究[D];山东农业大学;2013年

8 卢珊;磷脂酰肌醇3-磷酸在本氏烟与疫霉互作中的功能研究[D];南京农业大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 李秀奇;辣椒疫霉效应分子RxLR98344蛋白结构解析和PcUE1酶活性研究[D];山东农业大学;2018年

2 王玉姣;辣椒疫霉效应因子RxLR129113与辣椒互作蛋白的筛选鉴定研究[D];山东农业大学;2018年

3 丁鹏;辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应分子克隆及RxLR23同源基因的功能研究[D];山东农业大学;2018年

4 张丽;辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）RxLR效应因子的克隆与功能分析[D];山东农业大学;2018年

5 张琪梦;辣椒疫霉6个RxLR和大豆疫霉1个CRN效应子的功能分析[D];南京农业大学;2017年

6 李舒恬;辣椒疫霉效应因子PcRxLR207与其寄主靶标RNA结合蛋白的功能研究[D];南京农业大学;2017年

7 刘青;哈茨木霉菌拮抗辣椒疫霉的转录组学研究[D];贵州大学;2019年

8 盛桂林;辣椒疫霉胞外效应蛋白SCR82的功能研究[D];扬州大学;2018年

9 王海娇;1,6-二氧-乙酰大花旋覆花内酯对辣椒疫霉的抑菌活性研究[D];河南农业大学;2018年

10 方海珍;辣椒疫霉效应分子RxLR19781蛋白结构的解析[D];山东农业大学;2017年

本文编号：2641120