基于高通量测序技术的卧龙国家级自然保护区林下土壤微生物群落研究

发布时间：2020-04-30 09:44

【摘要】：为了探究卧龙国家级自然保护区不同林下土壤微生物的种类、丰度以及群落结构的组成,采用Illumina HiSeq测序对高山灌木、高山草甸、针阔混交林、针叶林以及落叶阔叶林林下土壤样品的细菌和真菌群落进行研究,利用细菌16S rRNA V4区和真菌ITS1区序列,以97%的一致性(Identity)进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,运用Uparse以及Silva132数据库等软件或方法获取样品的有效序列并进行注释,最终确认微生物的种类及相对丰度,分析土壤理化性质以及与微生物的相关性。(1)通过高通量测序技术检测细菌16S rRNA V4区序列,卧龙国家级自然保护区不同植被类型林下土壤细菌的门水平上共有74个,门水平细菌主要分布于变形菌门(Proteobacteria),占39.72%、酸杆菌门(Acidobacteria),其含量占25.94%、放线菌门(Actinobacteria),占11.22%、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),占4.42%、绿弯菌门(Chloroflexi)占4.46%、棒状杆菌门(Rokubacteria),占2.32%、拟杆菌门(Bacteroidetes),占2.06%以及硝化螺旋菌门(Nitrospirae),占1.61%。不同植被类型林下土壤属水平的细菌共有738个,过滤去除掉未注释识别到的物种,相对丰度大于1%且整体丰度排名前三的属水平细菌主要分布于Candidatus_Solibacter,占2.49%、苔藓杆菌属(Bryobacter),占2.53%以及鞘脂单胞菌属(Sphingomonas),占1.13%。从ITS1区序列注释检测出土壤真菌门水平上共有16个,主要分布于子囊菌门(Ascomycota),占34.46%、担子菌门(Basidiomycota),占28.22%以及被孢菌门(Mortierellomycota),占5.97%。土壤真菌属共有453个,主要分布于Archaeorhizomyces,占11.51%、丝盖伞属(Inocybe),占7.41%、Tricholoma,占2.50%、Tuber,占2.08%以及乳菇属(Lactarius),占1.79%。(2)从不同植被类型来看,相对丰度大于1%的优势属中,高山灌木的细菌有Candidatus_Solibacter,占2.91%和Bryobacter,占2.72%;真菌有Archaeorhizomyces,占18.48%、Inocybe,占6.91%、Hymenogaster,占1.81%以及Clavulina,占1.66%。高山草甸的细菌有Candidatus_Solibacter,占2.68%、Bryobacter,占1.92%、Sphingomonas,占1.15%以及Haliangium,占1.17%;真菌有Archaeorhizomyces,占15.84%、Ramariopsis,占7.38%。针阔混交林的细菌有Candidatus_Solibacter,占1.89%、Bryobacter,占2.13%、Sphingomonas,占1.78%;真菌有Inocybe,占8.47%、Tuber,占6.9%、Lactarius,占3.90%、Cortinarius,占3.16%、Hymenogaster,占2.63%以及Sebacina,占2.39%。针叶林的细菌有Candidatus_Solibacter,占2.34%、Bryobacter,占3.22%以及Sphingomonas,占1.18%;真菌有Archaeorhizomyces,占6.40%、Inocybe,占4.72%及Tuber,占5.84%。落叶阔叶林的细菌有Bryobacter,占1.11%、Sphingomonas,占1.26%以及Gaiella,占1.33%;真菌有Tricholoma,占47.80%。(3)Alpha多样性指数的组间差异分析中,细菌和真菌的多样性逐渐减少,且ACE指数、shannon指数以及chao1指数的组间差异分析结构都显示针阔混交林(ZKHJ)的指数结果最大。结合稀释曲线(Rarefaction Curve)和等级聚类曲线(Rank Abundance)的研究结果可知,不同植被类型林下土壤细菌的物种多样性是针阔混交林高山灌木针叶林高山草甸落叶阔叶林,土壤真菌物种多样性的为针阔混交林高山灌木针叶林高山草甸落叶阔叶林。可见,针阔混交林(ZKHJ)的微生物多样性极为丰富,其次就是高山灌木(GSGM),而相比之下落叶阔叶林(LYKY)的微生物多样性相对单一。(4)在Beta多样性分析中,UPGMA聚类树发现,卧龙国家级自然保护区不同植被类型林下土壤微生物的相似性存在一定的差异,发现高山灌木(GSGM)与高山草甸(GSCD)细菌群落结构相似性较高,针阔混交林(ZKHJ)与针叶林(ZYL)的细菌群落结构的相似性较高,但这两组细菌群落结构相似的植被类型与落叶阔叶林(LYKY)的有明显的的差别,相似性不高。(5)通过对土壤化学性质的检测,不同植被类型林下土壤的pH值、有机质、速效养分、碱解氮以及全量养分都会存在差异。从整体看来,通过Mantel_test分析发现pH值、有机质、速效养分、碱解氮以及全量养分等环境因子与细菌、真菌存在正相关。环境因子与微生物菌群之间存在相关性,土壤微生物与环境因子进行Spearman相关性分析,对比分析环境因子与微生物物种之间的相关性,以了解环境因子对微生物物种的影响。通过研究卧龙国家级自然保护区不同植被类型林下土壤微生物物种多样性、丰度、群落结构以及土壤微生物与理化性质的相关性,对了解林下土壤的可持续利用发展和经营管理具有重要作用,可为提高森林土壤肥力、改善土壤功能提供依据。
【图文】：

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图 1-2 卧龙国家级自然保护区地理位置示意图（摘自卧龙国家级自然保护区资源监管平台）1.5 样地设置与土样采集1.5.1 样地设置根据森林的垂直地带性分布，，在卧龙国家自然保护区的中河流域、皮条河流域和西河流域，选择植物群落具有典型性和代表性、且人为干扰小、交通便利及方便仪器操作的森林地带布设样地，并在样地中布设标准地。样地大小为20m×20m，并在样地的四角用 PVC 管标记，周围绳围，用 GPS 确定样地地理位置和海拔高度，样地共计布设 13 个，涵盖区域内六种典型植被：Ⅰ-落叶阔叶林，Ⅱ-针、阔混交林，Ⅲ-针叶林，Ⅳ-高山灌木林，Ⅴ-高山草甸，Ⅵ-常绿、落叶阔叶林，包括耿达片区、皮条河流域、中河流域等。具体设置情况见附表 1。

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R 产物；在根据 PCR 产物浓度将样品等量混和，待充分混匀后使用胶电泳检测 PCR 产物，使用 Qiagen 公司提供的胶回收试剂盒回收目。最后使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂构建，构建好的文库经过 Qubit 和 Q-PCR 定量，在文库合格后开始2500 PE250 进行上机测序。实验测序流程见图 2-3。样品准备 PCR 扩增DNA 提取与检测
【学位授予单位】：成都理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S714.3

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