类病毒在栗疫病菌中的侵染、复制和传播

发布时间：2020-06-07 09:36

【摘要】：类病毒是一类共价闭合的环状单链RNA,不编码任何蛋白质,其基因组大小在246-434 nt范围内。类病毒自身的稳定性强,不容易被脱氧核糖核酸酶降解。它是迄今发现最小的能进行自我复制的遗传因子。在自然界中,可引起十分严重的植物病害。国际病毒分类委员会将目前已经鉴定的44种类病毒分为两个科,七个属。本实验中,我们选取了具有不同属代表性的7种类病毒,它们分别是:马铃薯纺锤形块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid)、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid)、血苋类病毒1号(Iresine viroid 1)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid)、啤酒花矮化类病毒(Hop stunt viroid)、桃潜花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid)、鳄梨日斑类病毒(Avocado sunblotch viroid)。本研究所选用的丝状真菌为板栗疫病病原菌,该菌是属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目的寄生内座壳(Cryphenctria.Parasitica)。本课题主要研究类病毒能否侵染栗疫病菌并在栗疫病菌中进行复制。此外,研究类病毒的侵染对宿主真菌的生长,发育和致病性的影响。本实验为研究类病毒的宿主范围,发病机制和潜在的生物控制用途提供了新的研究思路和科学依据。本实验首先构建七种类病毒的侵染性克隆,将类病毒的体外转录物通过机械摩擦侵染烟草检验其活性;并通过转化的方法侵染酵母菌株,验证类病毒是否能在酵母菌株中进行复制。通过原生质体转化的方法将类病毒体外转录物人工导入C.Parasitica原生质体细胞中,细胞再生后,在PDA培养基上筛选转化子,提取栗疫病菌ssRNA,设计特异性引物,利用RT-PCR技术对类病毒的侵染情况进行检测。观察稳定侵染的类病毒对寄主真菌的生长、发育及致病力的影响。主要的研究结果如下:1.构建七种类病毒侵染性克隆:本实验利用体外转录的方法,构建了ASBVd HSVd IRVd PLMVd ASSVd IRVd CSVd七种类病毒的侵染性克隆质粒,获得体外转录类病毒RNA后,摩擦接种烟草检测其活性,并验证其是否能侵染酵母菌株AH109。2.检测七种类病毒侵染丝状真菌的能力:将七种供试类病毒导入C.Parasitica原生质细胞后,利用RT-PCR技术检测发现:ASBVd、HSVd、IRVd能够在C.Parasitica中进行复制,其中类病毒ASBVd的复制相较其他两种类病毒更为稳定;ASBVd侵染的菌株经过继代培养后提取ssRNA进行RT-PCR检测,实验结果表明,ASBVd的复制量无明显减少,其他两种类病毒的复制量随继代次数的增加而逐步降低。3.分析ASBVd侵染对C.Parasitica的影响:类病毒侵染后,对栗疫病菌表型产生一定影响,菌株的生长速率及色素积累量等发生变化。4.分析ASBVd在真菌寄主中的传播情况:ASBVd侵染C.Parasitica后,与真菌病毒相似,可通过寄主菌丝融合进行传播。经RT-PCR检测证实,类病毒可从带毒菌株传播至无毒菌株;将ASBVd侵染的C.Parasitica置于光照下培养至菌株产孢后,进行单孢分离培养,提取真菌ssRNA并利用RT-PCR技术检测发现,类病毒可通过孢子进行传播。5.分析ASBVd侵染真菌寄主后的遗传变异情况:类病毒侵染栗疫病菌后,将菌株继代培养,提取第8代菌株ssRNA进行检测并测序发现,随菌株继代培养后,类病毒序列发生了突变。6.对比、分析ASBVd野生型与突变株系的侵染活力及对寄主真菌的影响:ASBVd突变株系侵染栗疫病菌后,菌株气生菌丝的量增加,生长力无明显变化,提取真菌ssRNA进行检测,结果表明,ASBVd的复制量与野生型中相比有所降低,侵染活力有所下降。
【图文】：

类病毒,二级结构

类病毒是一类十分重要的病原物，从物质构成上来说，它是一类裸露的没有包被的单链环状 RNA 分子；类病毒是目前研究报道中最小的复制因子（Grot al. 2010）。类病毒的基因组大小在 246-436 nt 范围之内，，基因组并不大（黄2007）。类病毒的寄主范围在高等植物中十分广泛，但在真菌、动物和原生它真核生物细胞中尚未发现。由于类病毒自身不能编码蛋白质，它的复制与须依赖于寄主的相关蛋白（郭瑞 2006）。类病毒的二级结构一般呈棍棒状的碱基配对率很高，因此其结构相对稳定。大多类病毒的 RNA 结构包含了5 个主要的功能区域（图 1-1）：最左端的左手区(TL)和最右端的右手末端区(的致病区(P)、中央保守区(C)和可变区(V)（José-Antonio Daròs et al. 2006）。同的主要区域有各自不同的生物学功能，其中与类病毒所致病害的症状关系的区域为 P 区；主要控制类病毒复制相关因子的区域是 C 区；其中 TL 区和的保守序在类病毒的复制过程起着十分重要的作用，这一区域有利于复合酶Owens RA et al. 2006）。其中 V 区序列的可变性是最大的，即使是相近科的该区域中序列的相似程度也都小于 50%。研究表明，V 区部分序列的变化也类病毒的复制能力。

类病毒,代表种

（Hostuviroid）：代表种有啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid）；椰子死亡类病毒属（Cocadviroid）：代表种有椰子死亡类病毒（Coconut cadang-cadang viroid）；苹果锈果类病毒属（Apscaviroid）：代表种有苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid）锦紫苏类病毒属（Coleviroid）：代表种有锦紫苏类病毒 1（Coleus blumei viroid 1）。鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae）的全部类病毒分子在复制过程中会形成一种具有核酶活性的锤头状结构，该科的类病毒分子在复制过程中能够进行自我切割，他们以对称型的滚环模式进行复制，其侵染植物后主要的复制和积累场所是植物的叶绿体，这一科的类病毒又可以细分为不同的四个属，其主要的分类依据是类病毒分子中的 G+C 含量和分子处于最低自由能时的二级结构特征(其中杆状分子包含一些基环结构或呈分支状结构)，该科的类病毒主要分为鳄梨日斑类病毒属（Avsunviroid）：代表种有鳄梨日斑类病毒（Avocado sunblotch viroid）；桃潜花叶类病毒属（Pelamoviroid）：代表种有桃潜花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid）。近年来新发现的茄潜隐类病毒属(Elaviroid)也具有该科的分类特征（Flores R et al. 2004; HuY et al. 2002）。马铃薯纺锤块茎科和鳄梨日斑科的类病毒成员有着不同的生理特性，具体的如（表 1-1）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.13

【相似文献】