园林绿化废弃物腐熟中木质素和纤维素降解菌的筛选诱变及扩繁

发布时间：2020-06-20 09:06

【摘要】：随着我国城市园林绿化事业的大力发展,每年产生了大量的园林绿化废弃物,如何将城市园林绿化废弃物变废为宝成为亟待解决的问题。以堆肥技术为代表的生物处理方法,可以实现园林绿化废弃物资源化利用,但园林绿化废弃物中木质素和纤维素含量高,导致堆肥效率低。为了加快园林绿化废弃物堆肥效率,拟从堆肥中筛选出高效的木质素和纤维素降解菌,并通过诱变技术提高它们对木质素和纤维素降解能力,并探讨其基因功能、扩繁工艺以及酶学特性。利用苯胺蓝和羧甲基纤维素(CMC)-刚果红培养基褪色圈法、实验室固态发酵试验、酶活力定量检测,共筛选到了3株相对优势的木质素和纤维素降解菌:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BL03、曲霉菌属(Aspergillus sp.)BL06、土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)BL15,其中 B.subtilis BL03 产 CMC 纤维素酶和漆酶,Aspergillus sp.BL06 产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶,Geobacillus sp.BL15产CMC纤维素酶。利用常压室温等离子(ARTP)对分离出的菌诱变并定向筛选,发现Aspergillus sp.BL06对ARTP诱变不敏感、致死率不明显,而Geobacillus sp.BL15诱变后未筛选到有明显突变的菌株,故暂停该两株菌的诱变和筛选工作。控制B.subtilis BL03诱变条件,使其在致死率约95%进行诱变。基于酶标仪,以对苯胺蓝脱色率为指标,结合在CMC-刚果红培养基褪色圈直径,对B.subtilis BL03诱变后突变株进行了初筛;再通过滤纸法观察透明圈、测定酶活力等方法复筛,确定了 2株正向突变株,并观察其基因稳定性。最终确定1株突变株B.subtilis BLAR1,20代传代培养后,CMC纤维素酶和漆酶活力分别为(U/mL):162.67、21.30,较B.subtilis BL03 分别提高 49.69%和 35.18%。将B.subtilis BLARl和BL03应用到园林绿化废弃物堆肥试验,并以黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)和未接菌剂的空白处理作为对照,在堆肥开始(0d)和堆肥30 d两次添加了堆肥菌剂。通过堆肥试验发现:①以CMC和苯胺蓝为底物筛选得到B.subtilis BL03在园林绿化废弃物堆肥中具有较好的木质素和纤维素降解能力,60 d堆肥较不加菌剂的空白对照,显著提高木质素降解率6.25%、纤维素降解率46.92%;②经ARTP诱变,获得的突变株B.subtilis BLAR1较B.subtilis BL03显著提高了纤维素降解能力10.5%,但木质素降解能力没有提高,与在实验室培养状态下酶活力提高的幅度有较大差距。利用Illumina Hiseq Xten,对B.subtilis BL03和BLAR1进行了全基因组分析,观察到该两菌在GO功能基因库方面的基因没有明显的区别。分析碳水化合物代谢相关的基因,发现B.subtilis BLAR1较BL03在碳水化合物酯酶基因方面增加了 1条CAZy基因数据库中EC10家族基因,该基因与乙酰木聚糖酯酶、肉桂酰酯酶、阿魏酸酯酶、羧酸酯酶、S-甲酰谷胱甘肽水解酶等酶相关,可能突变株酶活力增强与此有关,有待进—步验证和研究。为了便于菌剂产业化扩繁,研究获得了B.subtilis BLAR1工业级培养基配方(g/L):葡萄糖9.0、甜菜糖蜜15.0、玉米浆干粉20.0、黄豆饼粉20.0;最适培养温度为37℃、在恒温振荡器的培养最经济转速是200 rpm、最适初始生长pH范围是5.5-6.5,培养周期24h。将上述实验室扩繁参数与菌剂工厂的实践经验相结合,提出了菌剂生产工艺手册——《堆肥菌剂B.subtilis BLAR1扩繁工艺手册》,详见附录A。B.subtilis BLAR1所产CMC纤维素酶和漆酶最大积累时间度分别为48 h和60 h;酶活力最适pH都是6.0-9.0;最适温度是30-50℃,这些特性有利于该菌酶系在园林绿化废弃物堆肥中发挥作用。在酶诱导剂试验中,发现微晶纤维素和玉米芯对B.subtilis BLAR1产CMC纤维素酶有显著的诱导作用,而玉米秸秆和麦麸没有诱导作用;愈创木酚、香兰素、DL-苯丙氨酸对B.subtilis BLAR1产漆酶没有诱导效果。鉴于B.subtilis BLAR1最适生长温度在37℃,而所产CMC纤维素酶和漆酶活力最适温度都是30-50℃,为了提高该菌在园林绿化废弃物堆肥中使用效果,建议在环境达到30℃堆肥时使用,加入堆肥后菌剂中微生物会快速繁殖,高温期结束后,温度降到40℃附近再次添加菌剂,促进堆体腐熟。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S141.4
【图文】：

百度,纤维素,半纤维素,木质素

林绿化废弃物腐熟中木质素和纤维素降解菌的筛选诱变及扩繁紧密相连组成的多相固体（Ｃｈｕｎｄａｗａｔ，Ｂｅｃｋｈａｍ邋ｅｔ邋ａｌ．．邋２０１１）支撑，植物将是柔幵的原生质堆（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，邋２００５）。这些材素、半纤维素，为了适应生长环境、抵御病虫害，这些物质质纤维素，他们以纤维素为骨架物质，半纤维素覆盖在纤隙由木质素与半纤维素填充，从而实现稳定的疏水结构状态（。所以园林绿化废弃物的木质素和纤维素含量高、Ｃ／Ｎ比降解利用。逡逑

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Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆｌｉｇｎｉｎ逡逑家对园林绿化废弃物处理的指导政策简述逡逑弃物的处理方法有很多，我国传统上采用焚烧或填埋的简便，但焚烧过程中会产生大量的烟气，以及甲烷和二２０１４ａ），加之近年我国许多城市雾霾污染越来越严重，禁止（童纪新、王青青，２０１８；吴群红、郝艳华，２０１８）。

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