荧光假单胞菌SN15-2抑制青枯劳尔氏菌的分子基础

发布时间：2020-06-28 09:45

【摘要】：青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种对农作物危害很大的土传性植物病原细菌,目前传统防治方法防效不理想。近年来,生物防治因其具有对环境友好、对人畜安全的特性成为植物病害防治研究的热点。为了筛选出对番茄青枯病具有较好防效的生防菌,我们在上海地区的番茄青枯病自然衰退土壤中采集土样,通过拮抗试验分离筛选到一株对该病原菌有很强抑制能力的菌株SN15-2,我们对菌株SN15-2进行了鉴定,并对其抗生素产生能力、定殖能力进行评估,然后通过盆栽试验,探究了 SN15-2对青枯病害的盆栽防效;再采用透射电镜和RNA-Seq技术,探究该生防菌抑制青枯劳尔氏菌的机制。首先,对分离筛选到的生防菌株SN15-2进行菌种鉴定,通过对其进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定,确定该菌株为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。荧光假单胞菌SN15-2可以产生噬铁素并具有生物膜形成能力,但不能产生蛋白酶。通过对其抗生素基因进行PCR扩增及目的基因条带测序,发现该菌株还产生2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、硝吡咯菌素(PRN)、藤黄绿脓菌素(PLT)和氢氰酸(HCN)等物质。采用利福平对SN15-2进行抗性标记,然后通过该菌株在番茄根际的定殖试验,发现SN15-2具有良好的根际定殖能力,第60天的时候,在番茄根部的定殖菌数仍然有3.67×105CFU/g(干土)。通过盆栽试验,探究荧光假单胞菌SN15-2对青枯病的防治效果,发现SN15-2的生防效果达到46.58%,对照组的硫酸链霉素的防治效果为32.67%,由此可见,SN15-2的生防效果明显好于硫酸链霉素。其次,我们通过线性拟合法,计算了荧光假单胞菌SN15-2 48h发酵液对青枯劳尔氏菌12h的半抑制浓度,发现其半抑制浓度为23.4%。我们分别通过透射电镜负染法和超薄切片法,研究了在半抑制浓度下,荧光假单胞菌SN15-2代谢产物对青枯劳尔氏菌的影响,发现SN15-2可以破坏该病原菌的细胞壁和细胞膜,并造成其细胞质的溢出。最后,我们采用RNA-Seq技术,探究了荧光假单胞菌SN15-2抑制青枯劳尔氏菌的分子机制。发现在SN15-2的代谢产物的胁迫作用下,青枯劳尔氏菌一共264个基因的表达量发生显著变化。对表达量显著变化的基因进一步分析发现,SN15-2的代谢产物可以通过抑制整合膜蛋白的合成,造成细菌在生长和分裂的时候细胞膜的损伤;通过上调表达胞壁质水解酶和下调表达二氨基庚二酸破坏细菌的细胞壁;通过加强青枯劳尔氏菌核酸分解代谢同时抑制其核酸合成代谢,抑制青枯劳尔氏菌的增殖和代谢;SN15-2的代谢产物中含有噬铁素可以给青枯劳尔氏菌造成铁吸收压力,影响青枯劳尔氏菌的生长和代谢。另一方面,为了抵抗荧光假单胞菌SN15-2的胁迫作用,青枯劳尔氏菌上调表达了热激蛋白、DNA保护蛋白、有机氢过氧化物抗性蛋白和甘氨酸甜菜碱以减轻SN15-2对其细胞膜、蛋白质和DNA造成的损伤;同时,多药物抗性蛋白的上调使得青枯劳尔氏菌有更强的毒性物质外排能力。然而,由于SN15-2代谢产物对青枯劳尔氏菌的毒性作用,青枯劳尔氏菌的广谱抗性蛋白不但没有在胁迫作用下上调表达,反而是受到了抑制,这也暗示了在荧光假单胞菌SN15-2代谢物胁迫作用下,该病原菌的有些抗性机制已经失效。本研究从土壤中分离得到一株防治青枯病的优良菌株荧光假单胞菌SN15-2,丰富了防治青枯病的微生物资源,并探究了荧光假单胞菌SN15-2防治青枯劳尔氏菌的分子基础,为应用生物防治技术防治青枯病害奠定了理论和应用基础。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.1;S436.412.15
【图文】：

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荧光假单胞菌SN15-2抑制青枯劳尔氏菌的分子基础

sN15-2在光学显徽镜下的形态

【参考文献】