飞蝗卵泡细胞间通道的体外模型构建及关键调控因子鉴定

发布时间：2020-08-07 08:41

【摘要】：飞蝗(Locusta migratoria)是我国重要的农业害虫,强大生殖力是飞蝗暴发成灾的一个重要生物学因素。昆虫卵成熟过程中需要储存大量的卵黄蛋白,为之后的胚胎发育提供营养物质,因此卵黄发生(vitellogenesis)是昆虫生殖发育过程的重要事件。在以飞蝗为代表的昆虫中,卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)在脂肪体中合成,由血淋巴运输到卵巢,被发育中的卵母细胞吸收。卵母细胞被一层致密排列的卵泡细胞层包裹,Vg首先需要穿过卵泡细胞间的通道(patency)才能到达卵母细胞表面,进而被卵母细胞通过内吞机制吸收。根据已有的报道,保幼激素(juvenile hormone,JH)能够调控胞间通道的开启,但是由于缺乏胞间通道在体内和体外动态变化的观察方法,限制了胞间通道调控机制的研究进展。此外,JH调控胞间通道开启的关键信号因子也有待揭示。飞蝗的卵黄生成和胞间通道开启主要由JH调控,而且其胞间通道开启对JH的响应较为敏感,因此,飞蝗是研究保幼激素调控卵泡细胞间通道分子机制的一个理想模型。本论文利用飞蝗的优势展开三个方面的研究:一是通过使用合适的染料和方法对卵泡细胞进行染色,建立起一套快速且清晰的观察胞间通道的方法,为胞间通道的深入研究奠定基础,并在此基础上进一步观察不同发育阶段卵泡细胞间通道的形态变化;二是建立JH诱导胞间通道开启的动态观察模型,为研究JH调控胞间通道的分子机制研究体外模式;三是利用RNAi对G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)的部分家族基因进行功能分析,筛选影响胞间通道开启的关键因子,初步解析JH调控胞间通道开启的膜信号通路。研究结果显示,CellMask Orange Plasma membrane Stain能够在活细胞状态下对卵泡细胞膜染色,且细胞的轮廓清晰,胞间通道的形态能够直观且完整显示。正常发育条件下对各阶段的卵泡细胞观察表明,卵黄发生前期,首个卵母细胞长度不超过1.5 mm时,胞间通道处于关闭状态。进入卵黄发生期,首个卵母细胞长度在1.5-5.5mm之间时,胞间通道逐渐扩大。在卵黄发生末期,首卵长度大于5.5mm时,胞间通道打开到最大状态,并在长度超过6mm后迅速关闭。根据上述结果推测,胞间通道从卵黄发生前期的关闭状态,进入卵黄发生期打开并逐渐增大,到卵黄发生末期短时间内迅速关闭。在整个卵黄发生期,胞间通道打开后不再关闭,直至卵母细胞发育成熟。为了建立JH诱导胞间通道形成的体外模型,我们基于以上实验基础和文献报道,利用JH III及其类似物(methoprene,JHA)在体外对处于卵黄发生中期的卵泡细胞进行诱导,观察胞间通道的变化。结果显示,在10~(-8)M的JH或JHA诱导条件下,胞间通道在1小时内明显增大。体外模型的建立可以为深入研究JH调控胞间通道形成的信号转导机制提供良好的实验材料,有助于推动JH膜信号传递的分子机制研究。前期研究结果表明,可能是介导JH信号并调控胞间通道开启的重要因子。我们利用RNAi对12个GPCR基因进行了干扰,观察其在卵黄发生中的作用。结果表明,其中的5个基因,包括orphan receptor(OrR)、cardioacceleratory peptide receptor(CCAPR)、methuselah-like 2(Mthl2)、parathyroid hormone/parathyroid hormone-related peptide receptor(PTHR)和tyramine receptor 2(TyR2),显著影响卵巢生长和卵母细胞成熟。进一步的Western blot检测显示,OrR和CCAPR干扰后,Vg在脂肪体和血淋巴中的含量增多而在卵巢中减少,表明卵巢生长和卵母细胞成熟受到抑制是因为卵母细胞不能正常吸收Vg导致,这两个基因是否参与胞间通道调控而影响Vg吸收有待于进一步研究。Mthl2、PTHR和TyR2干扰后,Vg在脂肪体中没有变化,而在血淋巴和卵巢中减少;结果说明,Mthl2、PTHR和TyR2干扰后,卵巢生长和卵母细胞成熟受到抑制是由Vg不能正常分泌到血淋巴中引起的。综合上述结果,我们摸索了一套观察胞间通道动态变化的染色方法,建立了JH诱导胞间通道的体外模型。另外,我们筛选了两个GPCR基因即OrR和CCAPR作为调控胞间通道开闭的候选基因。研究结果将为阐明JH调控卵泡细胞间通道的分子机制提供基础和参考。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.2
【图文】：

形态图,形态,方式,卵泡细胞

图 3-1 用不同的染色方式观察到的胞间通道的形态Alexa Flour 488 Phalloidin 和 Hoeschst 33342（Sigma-Aldrich）染料对卵泡细胞色，观察胞间通道形态；蓝色部分显示为细胞核，绿色部分显示为细胞骨架。gglutinin, Alexa Flour 594 染料对卵泡细胞的细胞膜上多糖染色，观察胞间通为细胞骨架。（C）CellMaskTMOrange Plasma membrane Stain 染料对卵泡细胞染色，观察在活细胞状态下胞间通道的形态；橘黄色部分显示为细胞骨架Figure 3-1 Patency observed with different staining patterns激素类似物体外诱导胞间通道打开育状态下胞间通道的形态不同发育阶段胞间通道形态，我们收集正常发育各阶段卵小管进行数观察。

形态图,形态,卵黄发生,表型

图 3-2 不同发育阶段的胞间通道形态生前期，不同首卵长度时卵小管的表型以及胞间通道的形态。（B）卵黄发生期小管的表型以及胞间通道的形态。（C）卵黄发生后期，不同首卵长度时卵小以及胞间通道的形态Figure 3-2 Patency of the different development stages激素类似物剂量依赖性诱导胞间通道打开上研究，飞蝗卵巢在不同发育阶段相对应的胞间通道形态也不一样。对胞间通道的影响，用 JH 类似物在体外对卵母细胞进行诱导，观察胞

类似物,小管,比例混合,混合培养

e Insect Medium）中 37 oC 孵育 1 小时，将孵育后卵小管分别浸润、10-8M 和 10-9M JHA 的细胞培养基中，诱导 1 小时，并以未经 J对照。用 CellMaskTMOrange Plasma membrane Stain 染料对卵小管焦显微镜下观察胞间通道。结果发现经 JH 类似物诱导后胞间通道开，50 %不变结果。为提高诱导实验稳定性我们更换 Basal MedGlutamine 和 Schneider’s Drosophila Medium w/L-Glutamine (SDM)细导实验，发现诱导结果仍不稳定，后我们将 BME 和 SDM 培养基3 比例混合两种后诱导胞间通道打开达 90 %以上。对卵母细胞在 BME 和 SDM 混合培养基（2 : 3）中诱导后，如图 M 和 10-9M 浓度的 JH 类似物 JHA 诱导卵小管后，胞间通道相较的，而用浓度为 10-6M 和 10-7M 的 JHA 诱导的胞间通道是没有变和 10-9M JH 类似物能够诱导胞间通道打开，尤其 10-8M 的浓度诱

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