分生孢子表面蛋白-天冬氨酸蛋白酶与球孢白僵菌发育分化及侵染致病的关系

发布时间：2020-10-11 15:41

　　 天冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteases,APs)是一类以天冬氨酸残基作为催化活性位点的蛋白水解酶,广泛存在于动植物、真菌、细菌和病毒中。研究表明,APs与动物的消化及植物的生长发育、真菌及细菌的侵染致病等过程密切相关。但APs作为一种表面蛋白与真菌发育分化及侵染致病的关系尚不清楚。课题组在研究昆虫病原真菌球孢白僵菌(分生孢子、芽生孢子和虫菌体)表面蛋白时,发现一个分生孢子表面蛋白BBA_04972在基因组中注释为真核生物天冬氨酸蛋白酶,命名为CsAP1。本论文利用基因表达分析、基因破坏及过表达等方法研究了CsAP1的表达特性及其与球孢白僵菌发育分化和侵染致病的关系。主要研究结果如下:1.CsAP1序列及表达特性分析序列分析表明,CsAP1的编码区全长1939 bp,包含1个内含子,编码621个氨基酸的多肽,推测分子量为64.815 kDa,等电点为4.39。结构域分析表明,CsAP1属于天冬氨酸蛋白酶家族,含有2个天冬氨酸残基。多重序列比对发现,CsAP1序列含有两种特征性催化指纹“DTGS和DTGT”。系统进化树分析显示,CsAP1与核盘菌同源蛋白聚为一簇。基因表达特性分析表明,CsAP1在分生孢子中表达量较高,在虫体内分化的菌体中表达水平较低,且主要受昆虫体壁营养诱导表达。通过表达融合P_(gpdA)::CsAP1::eGFP基因观察发现,融合蛋白仅分布于分生孢子表面,而在其它形态细胞中均未观察到荧光,推测其可能分泌到胞外。这些研究结果表明,CsAP1是一个表面蛋白,可能参与球孢白僵菌对昆虫营养的利用。2.CsAP1与球孢白僵菌生长发育及分生孢子表面特性形成的关系为探究CsAP1与球孢白僵菌发育分化的关系,分别构建了基因破坏(?CsAP1)、过表达(OE-CsAP1)和回复互补(Comp)菌株。研究发现,破坏CsAP1不影响菌株生长,但导致分生孢子产量降低。无论是在营养贫瘠还是营养丰富的培养基上,?CsAP1分生孢子产量显著低于野生型菌株(WT)(26.7%~76.7%),而OE-CsAP1和Comp的产孢量与WT无明显差异。由此表明,CsAP1参与分生孢子产生。细胞表面疏水性测定结果表明,破坏CsAP1导致分生孢子疏水性降低(22.93%),而过表达CsAP1则显著提高了分生孢子的疏水性(88%)。附着性测定结果显示,OE-CsAP1分生孢子在疏水基质上的附着性比WT提高了33.18%~38.32%,在亲水基质上的附着性比WT降低38.88%~43.18%,而?CsAP1在亲水基质上的附着性比WT提高了23.67%,Comp在两种基质上的附着性与WT无明显差异。在弱极性基质上,OE-CsAP1分生孢子的附着性比WT降低44.48%~68.26%,而?CsAP1和Comp的附着性与WT无显著差异。由此推测,CsAP1参与球孢白僵菌分生孢子表面特性形成。3.过表达CsAP1增强蛋白酶的活性利用脱脂奶粉和酪蛋白平板法测定球孢白僵菌分泌的蛋白酶活性,结果显示,当脱脂奶粉或酪蛋白存在时,OE-CsAP1的蛋白透明水解圈与菌落直径之比(0.69/0.21)显著大于WT(0.23/0),而?CsAP1和Comp的蛋白透明水解圈与菌落直径之比与WT无明显差异。由此表明,过表达CsAP1提高了胞外蛋白酶的产生。4.CsAP1参与球孢白僵菌对昆虫营养的利用在昆虫体壁或血淋巴营养培养条件下,?CsAP1气生菌丝生长稀疏且生物量积累降低,而OE-CsAP1和Comp与WT无明显差异。由此推测,CsAP1参与球孢白僵菌对昆虫营养的利用。5.CsAP1是球孢白僵菌的一个毒力因子以大蜡螟三龄幼虫为试虫,采用体壁浸染和血腔注射两种接种方式进行生物测定。结果表明,?CsAP1毒力降低,而OE-CsAP1毒力提高,Comp与WT无明显差异。虫菌体生物量测定结果显示,?CsAP1虫菌体数量比WT降低了27.21%~50.7%,而OE-CsAP1虫菌体数量比WT提高了7.6%~59.5%。由此表明,CsAP1参与昆虫营养利用,影响菌株毒力。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S476.12
【部分图文】：

子的形式摄取血淋巴中的营养物质并大量繁殖；(3)在昆谢产物等逃避宿主的免疫应答，致昆虫死亡；(4)在适宜体壁产生分生孢子进入下一轮侵染循环(图 1.1) (Pedrinez et al., 2016; Wang and Wang, 2017)。在侵染过程中，降解昆虫体壁协助其入侵，如蛋白酶、几丁质酶和脂酶为侵染打开通道，同时也为自身生长提供营养物质(Fang(Metarhizium anisopliae)中类枯草杆菌蛋白酶 Pr1 和丝昆虫体壁过程中发挥重要作用，Pr2 促进 Pr1 降解昆虫化酶表达，引起黑化反应，以应对昆虫的免疫应答(St Le et al., 2014)。几丁质是昆虫体壁的主要成分，几丁质酶一个重要的毒力因子，研究表明，破坏几丁质酶基因会 et al., 1998; Greenfield et al., 2014)。昆虫表皮最外层蜡脂肪酸和烃类物质。其中，不同烃类物质促进或抑制分响其侵染(Pedrinietal.,2013)。细胞色素 P450 基因 Bbcy响菌株毒力(Zhang et al., 2012)。

孢白僵菌不同形态细胞。(A)透射电镜观察球孢白僵菌分生孢子、芽生孢子及虫菌体细色观察球孢白僵菌不同形态细胞表面碳源表位(Wanchoo et al., 2009)。(C)透射电镜观察 D前后的虫菌体(Yang et al., 2017)。1.2 Different cell morphologies of B. bassiana. (A) TEM images of high-pressure frod B. bassiana conidia, blastospores and hyphal bodies. (B) DIC and fluorescence images of lecf B. bassiana cell morphologies (Wanchoo et al., 2009). (C) TEM images of B. bassiana hyphal boand following treatment with dithiothreitol DTT or protease K (Yang et al., 2017).菌细胞表面蛋白胞壁是病原真菌与宿主或外界环境接触的第一道屏障，具有保护细化学损伤、排除异物以及其它病原微生物的侵害等作用(Money,1999yhani, 2005; Holder et al., 2007; Lewis et al., 2009)。蛋白是真菌细胞壁包括细胞壁合成和降解所需的酶及结构性蛋白等。细胞壁蛋白与病原及逃避昆虫免疫识别密切相关，如生物被膜形成和昆虫体表附着等08)。其中，细胞壁蛋白主要分为两类，包括与细胞壁多糖共价偶联

西南大学硕士学位论文病的关系。课题的开展，将揭示分生孢子表面蛋白的生物学功能，可为球孢白僵菌致病性机制的研究提供理论基础。2.2 技术路线本论文拟采用的实施方案的技术路线如图 2.1。
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