一株二氯喹啉酸内生降解菌及其应用

发布时间：2020-10-18 07:11

　　 二氯喹啉酸是由德国巴斯夫公司(BASF)开发的新型激素型除草剂,主要用于防除水稻田稗草及部分双子叶杂草。因其具有用量少、持效期长、对稗草特效等优点而被广泛应用于农业。但由于其结构稳定,在田间降解缓慢,残留时间长,给环境安全带来潜在危害,并容易对后茬敏感作物产生残留药害,特别是在稻烟轮作区,由于前茬稻田使用除草剂二氯喹啉酸,其在土壤中的残留会导致后茬烟草产生严重的药害,严重影响了烤烟的产量和质量。本论文在此背景下,对二氯喹啉酸在土壤中的消解动态及其对后茬作物的药害进行了研究；从受二氯喹啉酸药害的烟草根系中分离出一株二氯喹啉酸内生降解菌Q3,通过形态特征、生理生化特性研究及16S rDNA序列同源性分析对其进行了鉴定,并对其降解特性进行了研究；同时,采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)对二氯喹啉酸的微生物降解产物进行了分析鉴定,提出了其可能的降解途径；通过室内盆栽试验及田间小区试验初步研究了菌株Q3对烟草药害的生物修复作用,探讨了二氯喹啉酸胁迫下降解菌对烟草保护酶系活性的影响,为其田间应用提供理论依据；对二氯喹啉酸内生降解菌的全基因组DNA进行了测序,并对其全基因组进行了初步分析,为阐明巨大芽孢杆菌Q3降解二氯喹啉酸的分子机理提供了理论基础。全文主要研究结果如下：采用优化的QuEChERS方法对土壤中的二氯喹啉酸进行前处理,建立了二氯喹啉酸在土壤中残留分析的高效液相色谱(HPLC)方法。当土壤中二氯喹啉酸添加浓度为0.05～1.0mg/kg时,采用优化的QuEChERS方法进行前处理的二氯喹啉酸添加回收率在90.17%-95.27%范围内,相对标准偏差在1.94%3.22%之间,能满足常规残留分析的要求,同时,采用QuEChERS方法可以大量减少有机溶剂的使用,且操作步骤比较简单,因而更适合用作二氯喹啉酸残留检测的常规前处理方法。采用配有紫外检测器(UV Detector)的岛津高效液相色谱仪(LC-20AT)对二氯喹啉酸的残留进行检测,发现低剂量(推荐剂量)下二氯喹啉酸的消解方程为Cx=0.984.e-0.024t,相关系数为0.9719,半衰期28.88 d；高剂量(2倍推荐剂量)下二氯喹啉酸的消解方程为Cx=1.5518.e-0.026t,相关系数为0.9905,半衰期为26.65 d。室内生测结果表明,二氯喹啉酸对烟草药害的主要症状表现为叶片扭曲畸形,在1mg/kg的浓度下烟草的生长完全停止并最终死亡。对其它几种后茬作物药害临界浓度的测定结果表明：二氯喹啉酸对番茄、辣椒的药害临界浓度为104mg/L；对胡萝卜、芹菜的药害临界浓度为10-5mg/L；对黄瓜的药害临界浓度为10-3mg/L。几种作物对二氯喹啉酸的敏感程度从高到低依次为：胡萝卜、芹菜、辣椒、番茄、黄瓜。由此可见,二氯喹啉酸对几种作物的生长均存在不同程度的抑制作用,在进行水旱轮作时,应根据二氯喹啉酸田间实际残留浓度合理选择轮作作物,减少除草剂残留药害的产生。采用无机盐平板划线法,从受二氯喹啉酸药害胁迫的烟草根系分离得到一株对二氯喹啉酸具有较好降解效果的内生降解菌,标记为Q3,Q3为革兰氏阳性菌。通过形态学特性、生理生化特性分析、biolog鉴定以及16S rDNA序列同源性分析,最终将菌株Q3鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。抗生素敏感性测试表明,该菌对青霉素及氨苄青霉素显示抗性。研究了二氯喹啉酸起始浓度、培养温度、培养基pH、接种量、摇床转速以及降解时间等因素对菌株Q3生长及降解二氯喹啉酸效果的影响。结果表明：适合Q3生长及降解二氯喹啉酸的最佳条件为：二氯喹啉酸起始浓度20mg/L、培养温度30℃C、pH 8.0、接种量6%、摇床转速180 rpm,在最佳培养条件下,菌株Q3在降解第7d对二氯喹啉酸的降解效果可达93%。采用HPLC-MS/MS方法对二氯喹啉酸的微生物降解产物进行了分析鉴定。结果表明：在二氯喹啉酸的微生物降解过程中,共检测到3种降解产物,分别为3,7-二氯-8-甲基喹啉、3-氯-8-羧酸喹啉、8一羧酸喹啉。通过降解产物推测菌株Q3对二氯喹啉酸的微生物降解途径可能是通过羧基还原作用及脱氯作用进行的。采用室内盆栽试验及田间小区试验,研究了二氯喹啉酸胁迫下内生降解菌Q3对烟草药害的修复效果,同时,分析了二氯喹啉酸胁迫下内生降解菌Q3对烟草植株内抗氧化酶等保护酶系(SOD、CAT、POD、APX等)活性以及MDA含量的影响。盆栽试验结果表明：在移栽后30d,菌株Q3生物修复组(Quinclorac+Q3)的叶长、叶宽及株高恢复到了空白对照的89.49%、92.14%及93.64%；移栽后45d,分别恢复到了空白对照的93.40%、91.70%及92.29%。田间小区试验结果表明：在菌株处理后11d,菌株Q3生物修复组(Quinclorac+Q3)的叶长、叶宽及株高恢复到了空白对照的90.49%、90.69%及88.95%；在菌株处理后22d,恢复到了空白对照的96.92%、93.83%及92.58%,盆栽试验和田间小区试验的结果均显示Q3对烟草二氯喹啉酸药害具有良好的恢复效果。对烟草抗氧化酶系活力测定的结果表明,在二氯喹啉酸胁迫下,内生降解菌Q3还可以提高烟草植株内保护酶系SOD、CAT、POD以及APX等酶的活性,并降低烟草植株内MDA的含量,从而减轻二氯喹啉酸对烟草的药害。采用第三代单分子实时测序系统PacBio RS平台对Q3菌株进行了全基因组测序,得到了其全基因组序列。测序原始数据经过过滤后,采用HGAP软件进行拼接,拼接序列进行反复校正,最终得到了Q3菌株的全基因组图谱。Q3的全基因组由一个大小为5,153,539 bp的环状染色体及一个大小为76,260 bp的环状质粒组成。染色体GC含量为38%。经PROKKA软件进行基因组注释后,共预测得到5,264个编码蛋白基因,172个RNA基因(包括130个tRNA基因和42个rRNA基因)。经与其它报道的巨大芽孢杆菌的全基因组比较,发现在巨大芽孢杆菌Q3的全基因组中,共有4694个核心基因,294个泛基因,216个特异基因。Q3菌株中含有1个质粒(Q3_p1),与菌株WSH-002中的质粒WSH-002_p1 (NC_017139)同源,与WSH-002_p1质粒相比,Q3_p1只有个基因BACMQ3_05432在WSH-002_p1中没有相似序列,为其特有基因。质粒Q3_p1中含有一套完整的rRNA基因集,还含有17个tRNA基因,组织结构与chromosome类似。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X592;X172
【部分图文】：

?湖南农业大学博±学位论文??．３二氯唾琳酸在止壤中的残留消解动态??采用配有紫外检测器（ＵＶ?Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）的岛津高效液相色谱仪（ＬＣ－２０ＡＴ）对二晰酸在±壤中的残留量进行检测，液相色谱图谱如图２－４所示。从图可Ｗ看出，唾晰酸的峰形较理想，对称性良好，且杂质去除较彻底，对二氯唾咐酸峰形干扰。??

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在室内采用前巧施用二氯哇晰酸的水稻±进行盆栽试验。烟苗于１２月３０日移栽，??在次年２月２日（即移栽后约３０ｄ）发现开始有明显药害症状出现，表现为必叶卷曲，??不能正常展开，但下部叶生长仍正常（图２－６上右）。??ｒ?—?。＇主判?Ｐ?？?；＊’?＇■?＾??ｙ＇＾ｃＬｏｄ??图２－６二氯睡嘟酸残留对烟草的药害症状??Ｆｉｇｕｒｅ?２－６?Ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ?ｓｙｍｐｔｏｍ?ｏｆ?ｔｏｂａｃｃｏ?ｃａｕｓｅｄ?ｂｙ?ｑｕｉｎｃｌｏｒａｃ?ｒｅｓｉｄｕｅ??２３??
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本文编号：2845985