西瓜噬酸菌miaA、hflX基因功能及sRNA研究

发布时间：2020-10-30 01:25

　　 瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB),是世界范围内的细菌性检疫病害,通过种传严重为害如西瓜、甜瓜等葫芦科作物,在世界各国的西、甜瓜产区普遍发生,并造成严重的经济损失。BFB的病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli),革兰氏染色阴性,单根极生鞭毛,最适生长温度24~28℃,能够通过III型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)将效应子(effector)直接注入到宿主细胞体内。目前,仍没有针对BFB的商品化的抗病品种。转录后水平的调控对于基因的表达、蛋白的正常装配、生命活动的维持具有重要意义。Hfq为RNA伴侣蛋白,能够同小型非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)一起对基因转录后水平做出调控,促进或抑制靶标mRNA的翻译。而MiaA是tRNA异戊烯焦磷酸转移酶,能够在促进翻译保真度方面发挥关键作用。此外,翻译阶段为了合成有效的多肽,需要额外的核糖体相关蛋白,HflX便是其中之一。编码HflX的基因位于hfq基因下游,能够编码GTP结合蛋白,利用GTP的水解可以驱动其他相关蛋白的功能循环。本实验通过对hfq、miaA、hflX基因进行生物信息学分析,了解了其在西瓜噬酸菌中的基因信息,为了研究基因的功能,通过三亲及同源重组交换构建了miaA、hflX基因的缺失突变菌株,并进行了基因的回补,获得了互补菌株,同野生菌株Aac5进行了各项表型的测定,并利用qRT-PCR测定了hfq、miaA、hflX三者之间可能存在的调控关系。此外,利用生物信息学预测及构建hfq过表达菌株,检测了西瓜噬酸菌中可能存在的Hfq依赖性sRNA,对其在压力环境下的表达量测定之后,选取候选sRNA NC-27在基因组中对其进行了敲除及回补,研究了其在西瓜噬酸菌中的功能并对其靶标mRNA做出了预测。结果如下:(1)通过生物信息学分析发现,西瓜噬酸菌中hfq基因所编码的Hfq蛋白含83个氨基酸,无特殊结构域,能够作为RNA伴侣蛋白行使功能;MiaA蛋白由350个氨基酸组成,具有两个低复杂度域和一个IPPT结构域,它可以催化反密码子附近腺苷的修饰;HflX由390个氨基酸组成,具有两个GTP结合结构域和一个Feo_B结构域。通过蛋白互作关系的预测后发现,Hfq、MiaA、HflX三者可能存在互作关系。(2)miaA、hflX的缺失均降低了西瓜噬酸菌对寄主的致病能力。miaA的缺失,使得西瓜噬酸菌Aac5的三型分泌系统关键基因hrpX显著下调,致病力及生物膜形成能力显著下降,褐色素分泌增多,但未影响其引起烟草过敏性反应的能力。而hflX基因的缺失,同样未对西瓜噬酸菌Aac5菌株引起烟草过敏性反应的能力产生影响。尽管表现出了更强的生物膜形成能力,但是运动能力却显著下降,同时,三型分泌系统关键基因hrpG、hrpE显著下调,其致病能力也显著下降。(3)miaA、hflX同hfq之间存在调控关系。经qRT-PCR测定后发现,hfq基因受到hflX、miaA基因正向调控,hflX基因受到miaA基因正向调控,miaA基因受到hflX基因负向调控。(4)在西瓜噬酸菌中预测到了31个sRNA,其中6个候选sRNA的稳定性依赖于Hfq蛋白。使用SIPHT在西瓜噬酸菌AAC00-1中预测到了31个潜在的sRNA,使用hfq过表达菌株的cDNA进行real-time PCR后发现,其中有6个sRNA的表达量显著上调,即这些sRNA的稳定性依赖于Hfq蛋白。在不同压力环境下,候选sRNA的表达量有所不同。(5)候选sRNA NC-27的缺失,增加了西瓜噬酸菌Aac5的致病能力。NC-27的缺失,增加了hrpG mRNA积累,致使T3SS蛋白HrpG增多,而作为hrpX的上游调控因子,其增多也导致了hrpX mRNA乃至HrpX的上调表达,同时,装置蛋白HrcJ也大量增加,使得其致病力增强。(6)使用Target RNA2在西瓜噬酸菌中共预测到了候选sRNA NC-27的29个靶mRNA,通过对NC-27的二级结构分析后发现,其在3’端具有一段富含尿嘧啶(U)的序列,能够同Hfq蛋白内圈氨基酸接触,而同候选靶mRNA的结合位点主要位于102~117核酸之间。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S432.42
【部分图文】：

文 图 1.1 瓜类细菌性果斑病的典型症状[10,15~16]Figure 1.1 Typical symptoms of BFB[10,15~16]酸菌为西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）[15~16]，革兰氏染光，严格好氧，单根极生鞭毛（图 1.2A），均大小约为 0.5 μm×1.7 μm[5]，于 KB 平板上呈圆形

林省和黑龙江省的西瓜和甜瓜发病率达15%，每年都造成十分巨大的经济损失。BFB作为一种检疫性细菌性病害，主要通过种子传播，在西瓜、甜瓜等植株的整个生长期均能发生侵染，染病初期会在子叶的背面形成水浸状病斑（图1.1），病斑最初呈离散分布，后沿叶脉逐渐扩展，连接成片，通过茎部到达真叶的组织，造成整个幼苗的坏死。在染病后期，水浸斑逐渐变干，并形成狭长，暗红色的枯斑。果实染病的典型特点是在瓜类果实表皮上形成零星的病斑，随后蔓延至整个果皮表面；同时，也可以向内侵入果实，严重时造成果肉腐烂。在香瓜叶片上，病斑由棕褐色变成红棕色，并从叶片边缘扩展呈V字形病斑。南瓜上除出现以上症状外，也可能出现大面积的黄萎。在整个循环期中，带菌种子是最主要的初侵染源，由于农耕和农播的进行，带菌种子进入土壤，6~10 d发芽后于苗期便可显症。此外

RNA 分子伴侣蛋白，具有六聚体环状结构。在原核针对特定的靶基因，能够对靶基因的转录后或是基 sRNA 的调控作用中，尤其是在反式调控（Tran，是目前已知的最为重要的 sRNA 结合蛋白之一。完全清楚，但是已有的数据表明，Hfq 至少在翻译的作用[67]。后、蛋白翻译前，Hfq 蛋白同 sRNA 一起对于靶式: 靶标 mRNA 原本具备正常翻译的条件，但当 ，能够占据核糖体上与 mRNA 结合的位点（RimRNA 无法正常结合于核糖体，阻碍其翻译的进行 会在 5'非翻译区自我互补配对形成二级结构，阻。Hfq 的正向调控方式是先与调控靶标 mRNA 的能够打开靶标 5'非翻译区上的二级结构，从而使得靶核糖体，促使靶标翻译的正常进行（图 1.3B）。
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 李乐书;葛艺欣;田艳丽;胡白石;;防治瓜类细菌性果斑病(BFB)生物种衣剂的研制[J];农业生物技术学报;2015年12期

2 严婉荣;王铁霖;杨玉文;戴良英;赵廷昌;;瓜类细菌性果斑病菌hrcN基因的生物学功能分析[J];植物病理学报;2015年01期

3 张悦丽;齐军山;张博;李林;徐作珽;郑继法;李长松;;山东省西瓜细菌性果斑病的病原菌鉴定[J];山东农业科学;2014年03期

4 吴丽媛;刘宝玉;王钰杰;刘双平;赵廷昌;胡俊;;甜瓜细菌性果斑病生防菌株BW-6的筛选和鉴定[J];植物保护;2014年01期

5 黄金艳;李文信;何毅;覃斯华;李天艳;洪日新;樊学军;;春雷霉素和农用硫酸链霉素对西瓜嫁接苗细菌性果斑病的防效[J];中国瓜菜;2010年06期

6 熊亮斌;刘箐;王天昌;高丽萍;王婧;刘姝彤;宋蕤;施颖波;王军平;文朝慧;;改良DAS-Dot-ELISA检测西瓜细菌性果斑病菌[J];微生物学通报;2010年10期

7 任争光;侯磊;宋治国;张力群;;甜瓜细菌性果斑病菌致病性突变体筛选与hrcR基因的克隆[J];植物病理学报;2009年05期

8 黄月英;;西瓜细菌性果斑病的检测与防治[J];福建农业科技;2008年02期

9 冯洁;徐进;许景升;何礼远;;Ⅱ型分泌系统与植物病原细菌致病性的关系[J];农业生物技术学报;2007年03期

10 许勇,张兴平,宫国义,张海英;细菌性果腐病与瓜类作物健康种子生产及检测技术(下)[J];中国西瓜甜瓜;2004年01期

相关博士学位论文 前1条

1 孙柏欣;西瓜噬酸菌越冬能力及两菌群在同一寄主定殖动态差异研究[D];沈阳农业大学;2016年

相关硕士学位论文 前1条

1 于畅;西瓜噬酸菌hrcQ、abmR和abmK基因功能分析[D];中国农业科学院;2018年

本文编号：2861761