猪粪中兽用抗生素检测方法及其季节性污染特征研究

发布时间：2020-10-31 13:01

　　 近年来,我国畜禽养殖业发展迅速,已成为农业农村经济发展的重要支柱产业。在生猪养殖过程中经常使用抗生素治疗疾病,30%~90%抗生素进入体内后以原药形式随粪便或者尿液排出,故猪粪便中普遍存在抗生素残留。猪粪农用会导致土壤中兽用抗生素残留,从而危害人类公众健康。为了解猪粪便中抗生素的污染程度,急需建立一套适合检测猪粪便中抗生素残留的方法。目前,关于抗生素检测方法的标准多针对食品、饲料以及有机肥,鲜粪中抗生素检测方法还没有国家标准。因此,如何精准快速检测猪粪中抗生素残留水平,并研究猪粪中抗生素的污染特征已成为环境科学领域的热点问题。本文主要开展如下研究内容:通过优化仪器方法(色谱和质谱)及前处理方法,建立猪粪中42种兽用抗生素的固相萃取-超高液相色谱串联质谱(SPE-UPLC-MS/MS)方法。主要对比Oasis Waters HLB、Agela Technologies Cleanert PEP和Oasis Waters PRiME HLB三种不同固相萃取小柱的萃取效果,比较了不同提取液、提取液的配比、提取液净化条件和洗脱液的用量等单因素实验中各种抗生素的回收率,确定了一套提取猪粪中42种抗生素的最优前处理方法。即采用10 mL的甲醇:乙腈:柠檬酸缓冲液(1:1:2)的提取液,涡旋3 min,超声10 min,在10000 r/min的转速下离心15 min,离心后收集上清液,提取猪粪两次,将上清液稀释到200 mL,过HLB小柱净化萃取,用6 mL的甲醇洗脱。氮吹至近干,用1 mL含0.1%甲酸水:甲醇(1:1,V/V)复溶至上样小瓶内等待上机,实验色谱柱选用Acquity HSS T3柱,以0.1%甲酸水和乙腈作为流动相,梯度洗脱分离42种抗生素,优化后的方法前处理操作便捷,8 min内实现42种抗生素分离,10 min完成检测,且定量限、检出限低,除青霉素G外其余物质定量限为0.03~5.13μg/kg,检出限0.01~1.54μg/kg。通过检测天津市不同规模猪场粪便中抗生素验证该方法,其结果显示与报道浓度水平趋于一致,表明该方法适用于猪粪中42种兽用抗生素的同时分析。为了解天津市不同规模猪场粪便中抗生素的季节污染特征,利用已经优化建立的方法对天津市典型规模猪场粪便中抗生素进行春、夏、秋、冬四季污染特征的监测。监测结果显示:猪粪中抗生素季节污染特征在小型养殖场中呈现的规律为夏季污染程度最低,冬季最高;中型养殖场呈现出的季节污染规律是秋季最低,春季最高;大型养殖场呈现出的季节污染规律是秋季最低,冬季最高,即整体上污染程度表现为春冬季夏秋季。在所有监测样品中,四环素类抗生素在不同规模猪场以及不同季节所占比重均最高,其中含量最高的为四环素类抗生素(TCs),总浓度可达1260.42 mg/kg,其中含量最高的单体抗生素为土霉素;β-内酰胺类(β-lacs)抗生素含量最低,总浓度可达0.26 mg/kg,其中含量最高单体抗生素为青霉素G(PENG);其他三类抗生素磺胺类(SAs)、喹诺酮类(FQs)和大环内酯类(MLs)抗生素,总浓度分别可达17.05、6.32和41.95 mg/kg,含量最高的单体抗生素分别为磺胺二甲嘧啶(SDMD)、氧氟沙星(OFL)和替米考星(TIL)。生猪不同生长阶段下抗生素的污染程度,在大多数情况下均为母猪污染程度最低,保育猪污染程度最高。此外,不同规模猪场中抗生素总浓度污染规律为:大型养殖场(存栏3000头)小型养殖场(存栏300头)中型养殖场(存栏1200头)。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X713
【部分图文】：

随着国家对种养结合理念的提倡，为了减少兽用响，如何精准快速检测猪粪中抗生素残留水平，并研究猪粪中抗科学领域的热点问题[9]。养殖业常用抗生素种类禽产品利益最大化，抗生素被作为饲料添加剂，用来预防动物疾的抗生素种类包含磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和类。物是一类在磺胺的母体结构中含对氨基苯磺胺基的抗生素。磺胺现的，是可以有效防治全身细菌性感染的人畜共用的抗菌药，具价格和广谱的抗菌效果，主要用于预防和治疗腹泻等细菌感染性，易光解，属于酸碱两性化合物[13-16]。农业部 168 号公告提出，预混剂、磺胺二甲嘧啶预混剂是可以根据疗程，加入到混饲里[1甲异嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺噁唑（磺胺二甲唑）、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺二甲（基）嘧啶、磺胺甲噻二唑（磺胺甲（磺胺多辛）、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺间二喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶等。磺胺类药物的结构见图 1-1：

东北农业大学理学硕士学位论文目前为止已经发展到第四代药物，其因属于抗菌广特点，在畜禽养殖业被广泛应用。喹诺酮的第一代及少部分变形杆菌有抗菌效果，如萘啶酸；第二代扩大，如恶喹酸；第三代，即氟喹诺酮类抗生素，沙星；第四代喹诺酮类抗生素发展为既有抗革兰氏和抗革兰氏阳性菌活性，价格比较昂贵，如加替沙生素被广泛应用，农业部 168 公告中提出，饲料中预混剂[14]，喹诺酮的作用机理是阻碍细菌中脱氧核NA 的损伤，致使其细菌细胞不能正常分化分裂[18]，酸碱两性，所以一般溶于稀酸和稀碱溶液[19]。环境中离子会与喹诺酮类药物结合成较为稳定的物质，这素吸附位点产生竞争性吸附[13,20]。喹诺酮类药物的

图 1-3 大环内酯类抗生素的一般结构Figure 1-3 General structure of macrolide类具有四苯基本骨架的抗生素，属于碱性广谱类抗去甲基金霉素和强力霉素。因其价格低廉，在世界菌感染性疾病。该类抗生素不仅可以作为用于治疗长的添加剂被加入到动物饲料内。农业部公告 168素钙预混剂和金霉素预混剂。我国是四环素药物生属于两性化合物，水溶性较好，在弱酸性溶液中较
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本文编号：2863978