苏云金杆菌Cry1A毒素与褐飞虱中肠内潜在受体互作分析

发布时间：2020-11-13 01:43

　　 Cry毒素作为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)产生的一类重要杀虫蛋白已被广泛应用于鳞翅目和鞘翅目等农业害虫的防治。随着含cry基因的抗虫转基因作物的大量种植,诸如飞虱、叶蝉、蚜虫、椿象等半翅目非Bt靶标昆虫很有可能发展成为主要害虫。虽然对此类害虫有毒性作用的Bt毒素已有报道,但已商品化使用的Cry1，Cry2等Bt毒素对此类害虫无毒或低毒的原因尚不明朗。膜穿孔机制和信号转导机制是目前关于Cry毒素的两种主要杀虫作用机制模型。在两种潜在模型中,靶标昆虫中肠内特定膜蛋白,如钙粘蛋白(Cadherin)、氨肽酶N(aminopeptidaseN，APN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及ABC转运因子(ABC transpoter C2，ABCC2)等与Cry毒素domain Ⅱ中暴露在毒素空间结构表面的3个环区(loop)相结合是其毒性作用发挥的关键。为此,本研究以半翅目水稻害虫褐飞虱(Nilaparvatalugens，brownplanthopper，BPH)为研究对象,分析褐飞虱中肠上皮细胞膜上可能与Cry毒素结合的蛋白,并对预测的蛋白进行序列及功能验证。首先通过第二代高通量测序技术对褐飞虱若虫中肠及全虫mRNA分别进行测序,构建褐飞虱转录组数据库。经生物信息学分析发现褐飞虱中肠内存在大量具有高丰度转录水平并与已知Cry毒素受体同源的膜结合蛋白,包括膜结合APN、ALP及Cadherin等。利用反转录PCR(RT-PCR)对褐飞虱中肠转录组数据中的apn、及cadherin基因序列进行验证后,对这些Cry毒素受体同源蛋白的功能域、三维空间结构、表达量以及糖基锚定(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)功能位点等特征进行了预测、分析,利用同源比对分析手段对上述蛋白与Cry毒素靶标昆虫中肠内已知结合位点进行序列比对。经以上分析,在褐飞虱中肠内共获得5个具备Cry毒素受体功能的膜结合蛋白,包括2个APNs(bphAPN1、bphAPN4)、2 个 ALPs(bphALP4、bphALP6)和 1 个 Cadherin(bphCadherinl)，证明褐飞虱中肠上皮细胞膜上存在可能作为Cry毒素受体的APN、ALP及Cadherin蛋白。利用Bac to Bac?杆状病毒表达系统,构建能够表达bphAPN4蛋白的杆状病毒载体,并利用草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系Sf9对bphAPN4蛋白进行真核表达。同时,将bphapn4基因序列、删除GPI位点的bphapn4基因序列(bphAPN41ackG)和bphapnl基因序列分别插入pMT/BiP/V5-His载体中,并转染入果蝇(Drosophlia)S2细胞系进行真核表达。免疫印迹、共聚焦荧光显微镜观察及蛋白质谱分析结果显示bphAPNs蛋白分别在Sf9及S2细胞系中成功表达,且bphAPN1蛋白和bphAPN4蛋白主要分布在细胞膜上,而bphAPN41ackG蛋白分布在细胞质中,并分泌到胞外。以亮氨酸对硝基苯胺(leucinep-nitroanilide，leu-p-NA)为底物,仅在表达了bphAPN1蛋白的S2细胞中能够检测到氨肽酶活性(36.33±0.33)。Toxin-overlay实验及免疫荧光定位结果显示S2细胞系中真核表达的bphAPN1和bphAPN4蛋白与CrylAc毒素无法特异性结合,而细胞生测结果显示无论是表达bphAPN4蛋白的Sd9细胞还是分别表达bphAPN1和bphAPN4蛋白的S2细胞均对CrylAc毒素不敏感。此外,为探究CrylAb毒素domainll中3个loops在Cry毒素作用机制中的重要性,对3个受体识别loops分别被外源短肽P2S替换后的CrylAb重构蛋白在胰蛋白酶水解作用下的稳定性进行了分析,结果显示loops的替换不会对CrylAb毒素的结构稳定性造成显著影响。体外结合实验及竞争性结合实验结果显示,与野生型CrylAb蛋白相比,3个CrylAb重构蛋白与棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicle,BBMV)的结合没有显著变化,且同样具有特异结合位点。Toxin-overlay结合实验证实无论是野生型CrylAb毒素还是3个CrylAb重构蛋白均和在S2细胞上表达的bphAPN1、bphAPN4蛋白无法特异性结合。而对棉铃虫幼虫的生测结果显示3个CrylAb重构蛋白的毒性作用显著低于野生型CrylAb毒素蛋白。其中loop2替换后的重构蛋白L2RCM对棉铃虫幼虫的毒性作用下降最为显著,其次是L3RCM。上述结果表明在CrylAb毒素受体识别域中,loop 2的重要性高于loop1和loop3。在CrylA鳞翅目靶标昆虫中肠内,高表达并具有糖基锚定等特征的APN已被证明是CrylAc毒素的重要受体。本研究结果显示,与鳞翅目中肠APN高度同源的bphAPN1和bphAPN4在褐飞虱中肠内有较高的转录水平,且具备类似的糖基锚定膜蛋白的特征。CrylAc毒素无法与其特异性结合是造成褐飞虱对CrylAc毒素不敏感的重要因素之一。该结果为深入了解CrylAc毒素作用机制,了解CrylAc毒素对半翅目刺吸式口器害虫水稻褐飞虱无明显毒性作用的原因提供了依据,也为通过分子改造等手段提升Cry毒素与昆虫中肠上特定蛋白的亲和活性从而获得对褐飞虱等半翅目昆虫具有毒性作用的新型Cry毒素的研究奠定了基础。本研究的特色和主要创新点包括:证实褐飞虱中肠内存在多个Cry毒素受体的同源蛋白;在两种昆虫细胞系中(Sf9和S2细胞)成功表达褐飞虱中肠上高转录水平的2个膜结合APN蛋白;对CrylAb毒素domain Ⅱ上3个受体识别loops在CrylAb毒性作用中重要性的差异程度进行了分析;发现CrylA毒素与褐飞虱中肠上2个膜结合APN无明显相互作用关系,从受体的角度分析CrylA毒素对褐飞虱无明显毒性作用的原因。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S476.1
【部分图文】：

图１－１?Ｃｒｙ毒素三维空间结构［９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｒｅｅ?ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ?ｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ?ｏｆ?Ｃｒｙ?ｔｏｘｉｎｓ??形成过程中分泌出的Ｃｒｙ毒素被称为原毒素不同＆￥原＿可以达到１３０ｋＤａ，如ＣｒｙｌＡ类毒素及Ｃｒｙ４Ｂ类毒素；有的、Ｃｒ３Ａ及ＣｒｌｌＡ在害虫中

是完整且有重复的，４．４９％?（１２０个ＢＵＳＣＯｓ）是片段，１１．４０％?（３０５个ＢＵＳＣＯｓ）??未能查找到，该结果表明组装数据的质量是可用的。??对ＯＲＦ预测结果进行统计分析，由ＯＲＦ长度分布图可知（图２－４），长度在??０－１００、１００－２００、２００－３００、３００－４００、４００－５００?区间以及大于?３０００?的?ＯＲＦ?数量均??在１０００个以上，长度在５００－３０００的ＯＲＦ数量呈现波动式减少，以２９００－３０００为??最低。ＯＲＦ长度统计表（表２－８）显示，经组装总共获得５３，０５３个ＯＲＦ，其长度??主要集中在０－３００，占总数７２．１３％的比例，长度在３００－５００、５００－１０００、１０００－２０００??的ＯＲＦ数量依次递增

Ｂｏｍｂｙｘ?ｍｏｒｉ??Ｃｅｒａｐａｃｈｙｓ?ｂｉｒｏｉ??图２－５褐飞鼠转录组Ｕｎｉｇｅｎｅｓ同源性分析??Ｆｉｇｕｒｅ?２－５?Ｈｏｍｏｌｏｇｙ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＢＰＨ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ?ｕｎｉｇｅｎｅｓ??对可与ＮＣＢＩ?ｎｒ数据库中参‘基因匹配的ｌ８，８〇ｌ个Ｕｎｉｇｅｎｅｓ?（Ｅ?ｖａｌｕｅ?ｓ?１０－５）进行Ｅ??值分布、序列相似性分布、物种分布统计分析。占比小于１％的部分未显示??Ａｌｌ?ｄｉｓｔｉｎｃｔ?ｇｅｎｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?（１８，８１０）?ｔｈａｔ?ｗｅｒｅ?ｈｉｔ?ｔｏ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｇｅｎｅｓ?ｉｎ?ＮＣＢＩ?ｎｒ?ｄａｔａｂａｓｅ?ｗｉｔｈ?ａ??ｃｕｔ－ｏｆｆ?ｏｆ?Ｅ－ｖａｌｕｅ?＜?１０?５?ｗｅｒｅ?ａｎａｌｙｚｅｄ?ｆｏｒ?Ｅ－ｖａｌｕｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，?ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｓｐｅｃｉｅｓ??ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．?Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ?ｌｅｓｓ?ｔｈａｎ?１％?ａｒｅ?ｎｏｔ?ｓｈｏｗｎ??２，３．２?Ｕｎｉｇｅｎｅｓ?的?Ｇ？注释??ＧＯ数据库是含有动物、植物、微生物在内的１００多个物种的数据庳，可对??蛋白的功能进行分类。整体上，ＧＯ分为３个不同的Ｏｎｔｏｌｏｇｉｅｓ，分别为细胞组??份（ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、分子功能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ）和生物．学途径（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ??ｐｒｏｃｅｓｓ）。本研究根据这三大类将褐飞虱的Ｕｎｉｇｅｎｅｓ进行功能分类，并将其进??步划分多个二级分类
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本文编号：2881547