爪哇根结线虫Mj-msp-33基因的克隆及功能分析

发布时间：2017-04-13 03:20

  本文关键词：爪哇根结线虫Mj-msp-33基因的克隆及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：根结线虫属于固着性专性植物寄生线虫,在侵染植物的过程中分泌多种与寄生相关的蛋白,称之为效应子蛋白。根结线虫的食道腺是合成效应子蛋白的重要场所,其合成的效应子蛋白往往具有N端信号肽,被分泌到食道中,最后通过口针注入植物体内。研究这些效应子蛋白的功能和作用,有助于人们进一步认识根结线虫与植物互作的分子机制,进而为根结线虫的防治提供理论基础。本论文根据南方根结线虫(Meloidogyne incognita)Mi-msp33基因的序列,利用同源克隆和RACE方法,从爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)中成功克隆了同源基因Mj-msp33,并获得了Mj-msp33全长cDNA序列。Mi-msp33基因片段的编码序列只有N端部分333 bp,本文获得的Mj-msp33基因的ORF全长1326 bp,编码一个442 aa的蛋白。Mj-msp33蛋白是一个新的爪哇根结线虫候选效应子蛋白,具有N端信号肽和一个pat4:KKHK核定位信号(NLS)。利用网络数据库进行同源比对,除了Mi-msp33蛋白,未在其它线虫种类和其它物种上发现与之同源的蛋白。通过原位杂交(In-situ Hybridization)、龄期表达分析和酵母双杂交(Yeast two-hybrid)等方法,对Mj-msp33基因的功能进行了初步的鉴定。利用地高辛(Digoxin)标记的特异性探针,进行原位杂交实验,结果表明,Mj-msp33在爪哇根结线虫侵染前二龄幼虫(pre-J2)的亚腹食道腺特异表达。龄期表达分析结果显示,Mj-msp33在爪哇根结线虫侵染前二龄幼虫(pre-J2)和侵染早期阶段(2dpi)表达量最高,以及在侵染后二龄幼虫(5dpi)表达量也比较高;此后随着线虫的发育,Mj-msp33的表达量逐渐降低,成熟雌虫时期表达量最低。利用酵母双杂交系统,通过构建爪哇根结线虫Mj-msp33的诱饵融合蛋白,进行酵母双杂交实验,筛选到一个与Mj-msp33蛋白存在相互作用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)蛋白,甘油磷酸二脂酶(Glycerophosphodiester phosphodiesterase,GDPD),拟南芥甘油磷酸二脂酶与细胞壁的结构和植物防御有关。根据本论文的研究结果,推测基因Mj-msp33可能对爪哇根结线虫的寄生有重要作用。
【关键词】：爪哇根结线虫 基因克隆 Mj-msp33 效应子蛋白
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.45
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-11
• 1 前言11-19
• 1.1 根结线虫的危害11-12
• 1.2 根结线虫的防治12-13
• 1.3 根结线虫效应子蛋白的研究进展13-17
• 1.3.1 改变植物细胞壁的结构14
• 1.3.2 分子模拟寄主内源信号14-15
• 1.3.3 抑制植物防御反应15-16
• 1.3.4 调控寄主的转录16-17
• 1.3.5 转录后修饰17
• 1.3.6 未知功能的效应子蛋白17
• 1.4 本研究的目的与意义17-19
• 2 材料与方法19-40
• 2.1 材料19-22
• 2.1.1 供试线虫种群与植株19
• 2.1.2 菌株与载体19
• 2.1.3 主要试剂与试剂盒19
• 2.1.4 主要溶液与培养基配方19-21
• 2.1.5 主要仪器与设备21
• 2.1.6 主要软件与网络数据库21-22
• 2.1.7 引物设计与合成22
• 2.2 方法22-40
• 2.2.1 供试番茄植株的培养22
• 2.2.2 供试线虫的培养与收集22
• 2.2.3 爪哇根结线虫总RNA的提取22-23
• 2.2.4 爪哇根结线虫总RNA反转录cDNA23
• 2.2.5 爪哇根结线虫Mj-msp33基因片段的同源克隆23-25
• 2.2.5.1 PCR扩增Mj-msp33基因片段23-24
• 2.2.5.2 PCR产物的纯化回收24-25
• 2.2.5.3 回收的PCR产物连接pMD18-T载体25
• 2.2.5.4 重组质粒的转化及筛选25
• 2.2.6 爪哇根结线虫Mj-msp33基因全长的获得25-27
• 2.2.6.1 5' RACE-PCR25-26
• 2.2.6.2 3' RACE-PCR26-27
• 2.2.6.3 Mj-msp33基因全长序列的扩增27
• 2.2.6.4 重组质粒pMD18-T-Mj-msp33的提取27
• 2.2.7 Mj-msp33在爪哇根结线虫中的原位杂交分析27-30
• 2.2.7.1 原位杂交实验探针的制备27-29
• 2.2.7.2 线虫的固定及处理29
• 2.2.7.3 杂交实验29-30
• 2.2.8 爪哇根结线虫Mj-msp33基因的龄期表达分析30-33
• 2.2.8.1 爪哇根结线虫卵的收集30-31
• 2.2.8.2 爪哇根结线虫侵染前二龄幼虫的收集31
• 2.2.8.3 爪哇根结线虫侵染后2龄幼虫、3 龄幼虫和4龄幼虫的收集31
• 2.2.8.4 爪哇根结线虫成熟雌虫的收集31
• 2.2.8.5 爪哇根结线虫各龄期总RNA的提取31
• 2.2.8.6 爪哇根结线虫各龄期cDNA的获得31-32
• 2.2.8.7 qRT-PCR分析Mj-msp33在爪哇根结线虫不同发育阶段的表达水平32-33
• 2.2.9 爪哇根结线虫Mj-msp33蛋白与拟南芥互作蛋白的初步鉴定33-40
• 2.2.9.1 诱饵载体pGBKT7-Mj-msp33的构建33-34
• 2.2.9.2 酵母菌株AH109感受态的制备34-35
• 2.2.9.3 诱饵载体转化酵母菌株AH10935
• 2.2.9.4 诱饵载体转化酵母菌株AH109阳性菌落的检测35-36
• 2.2.9.5 诱饵载体毒性与自激活检测36
• 2.2.9.6 酵母双杂交文库筛选36-37
• 2.2.9.7 酵母阳性菌落的验证37-38
• 2.2.9.8 酵母质粒的抽提38-39
• 2.2.9.9 酵母质粒转化大肠杆菌DH5α39
• 2.2.9.10 诱饵载体与筛选到的潜在互作因子的共转化39-40
• 3 结果与分析40-54
• 3.1 爪哇根结线虫Mj-msp33基因的克隆40-46
• 3.1.1 同源克隆40
• 3.1.2 RACE实验40-41
• 3.1.3 爪哇根结线虫Mj-msp33基因全长的扩增41-43
• 3.1.4 同源性分析43
• 3.1.5 理化性质分析43-44
• 3.1.6 爪哇根结线虫Mj-msp33蛋白结构预测44-46
• 3.1.6.1 Mj-msp33蛋白信号肽预测及跨膜结构域预测44-45
• 3.1.6.2 Mj-msp33蛋白亚细胞定位预测45
• 3.1.6.3 Mj-msp33蛋白磷酸化位点预测45-46
• 3.2 Mj-msp33在爪哇根结线虫中的表达定位分析46-48
• 3.2.1 探针的制备46-48
• 3.2.2 原位杂交实验48
• 3.3 爪哇根结线虫Mj-msp33基因的龄期表达分析48-49
• 3.4 爪哇根结线虫Mj-msp33蛋白与拟南芥互作蛋白的初步鉴定49-54
• 3.4.1 诱饵载体pGBKT7-Mj-msp33的构建49-51
• 3.4.2 诱饵载体pGBKT7-Mj-msp33转化酵母菌株AH10951-52
• 3.4.3 拟南芥互作蛋白的初步筛选52-53
• 3.4.4 诱饵蛋白与捕获蛋白共转化酵母细胞53-54
• 4 结论与讨论54-59
• 4.1 结论54
• 4.2 讨论54-58
• 4.2.1 Mj-msp33基因全长的获得54-55
• 4.2.2 Mj-msp33蛋白是爪哇根结线虫分泌蛋白55
• 4.2.3 Mj-msp33蛋白定位在植物的细胞核55
• 4.2.4 磷酸化修饰55
• 4.2.5 Mj-msp33在爪哇根结线虫pre-J2的亚腹食道腺中特异表达55-56
• 4.2.6 Mj-msp33在爪哇根结线虫侵染前和侵染早期阶段特异表达56
• 4.2.7 Mj-msp33蛋白与拟南芥GDPD蛋白存在互作关系56-58
• 4.3 本论文还需进一步解决的问题58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-66
• 附录66-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张亚侠;张文顺;;根结线虫的发生与防治[J];现代农业科技;2016年04期

2 龙海;李芳荣;程颖慧;谢泳桂;李一农;;根结线虫多样性研究进展[J];中国植保导刊;2016年02期

3 金娜;刘倩;简恒;;植物寄生线虫生物防治研究新进展[J];中国生物防治学报;2015年05期

4 郑立双;李向楠;孙城涛;刘红羽;刘勋;贺明;吕文发;;酵母双杂交技术及应用的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年09期

5 梁前进;王鹏程;白燕荣;;蛋白质磷酸化修饰研究进展[J];科技导报;2012年31期

6 叶德友;陈劲枫;;植物抗线虫基因与抗性机理研究进展[J];植物保护;2012年02期

7 路雪君;廖晓兰;成飞雪;刘勇;;根结线虫的生物防治研究进展[J];中国农业科技导报;2010年04期

8 李先昆;聂智毅;曾日中;;酵母双杂交技术研究与应用进展[J];安徽农业科学;2009年07期

9 牛俊海;郭仰东;简恒;;RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展[J];基因组学与应用生物学;2009年01期

10 崔汝强;廖金铃;卓侃;钟国强;;植物寄生线虫发育基因的研究进展[J];华中农业大学学报;2008年03期

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本文编号：302700