灰葡萄孢菌核形成相关基因的挖掘和功能研究

发布时间：2021-05-10 15:22

　　灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是一类世界性分布的死体营养型植物病原真菌,可侵染1,000多种植物,引起灰霉病（grey mould disease）,每年给农业生产造成严重的经济损失。由于其巨大的经济影响和科学价值,灰葡萄孢目前也已经成为研究死体营养型病原真菌的重要模式真菌。菌核是灰葡萄孢度过不良环境和繁殖的菌丝体结构,也是灰霉病的重要初侵染来源,抑制菌核的形成将切断灰霉病的病害循环。因此,研究灰葡萄孢菌核形成相关基因的功能和揭示菌核形成的分子机理将为灰霉病的有效防治提供新的理论依据。为了筛选出灰葡萄孢菌核形成相关的基因,利用转录组测序技术比较分析了灰葡萄孢菌丝生长阶段和菌核形成阶段的差异表达基因,结果发现与菌丝生长阶段相比,两次生物学重复分别有1318和1249个基因在菌核形成阶段显著上调表达,有853和943个基因显著下调表达,推测其中有些基因可能在菌核发育过程中发挥重要功能。以RNA-Seq测序数据为基础,根据基因表达水平筛选出了10个在菌核形成阶段明显上调表达的基因和1个明显下调表达的基因进行深入研究。首先利用RT-PCR检测了菌核形成过程中目标基因的表达水平,结... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 灰葡萄孢和植物灰霉病
        1.1 灰葡萄孢及其经济重要性
        1.2 灰葡萄孢的生活史与病害循环
        1.3 灰葡萄孢的致病机理研究
            1.3.1 灰葡萄孢的侵染结构
            1.3.2 灰葡萄孢的致病因子
            1.3.3 灰葡萄孢致病过程中的信号调控
    2 灰葡萄孢的菌核及形成机理
        2.1 菌核的结构与功能
        2.2 灰葡萄孢的菌核形成相关因子
            2.2.1 菌核形成相关的环境因子
            2.2.2 菌核形成相关的信号转导通路
    3 灰霉病的防治
        3.1 化学防治
        3.2 农业防治
        3.3 生物防治
    4 枯草杆菌蛋白酶类似蛋白酶的研究进展
        4.1 枯草杆菌蛋白酶类似蛋白酶家族概况
        4.2 枯草杆菌蛋白酶类似蛋白酶在病原真菌中的研究进展
    5 研究目的与意义
第二章 灰葡萄孢转录组测序及分析
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 试验菌株
            1.1.2 试验试剂和仪器
        1.2 试验方法
            1.2.1 灰葡萄孢菌核形成相关样品的总RNA提取
            1.2.2 灰葡萄孢菌核形成相关测序文库的构建
            1.2.3 测序数据预处理
            1.2.4 测序Reads比对到灰葡萄孢基因组及差异表达基因的筛选
            1.2.5 差异表达基因的层次聚类分析
            1.2.6 差异表达基因的功能富集分析
    2 结果与分析
        2.1 转录组测序样品收集
        2.2 Illumina RNA-Seq测序数据质量评估
        2.3 灰葡萄孢差异基因的检测
        2.4 差异基因功能富集分析
            2.4.1 DEGs的GO功能分析
            2.4.2 DEGs的Pathway通路分析
    3 结论与讨论
第三章 部分差异表达基因的敲除及其生物学功能的初步探究
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 试验菌株
            1.1.2 培养基和试剂
        1.2 试验方法
            1.2.1 灰葡萄孢基因组DNA的提取
            1.2.2 灰葡萄孢总RNA的提取
            1.2.3 第一链cDNA的合成
            1.2.4 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)
            1.2.5 灰葡萄孢基因的敲除策略
            1.2.6 灰葡萄孢原生质体制备
            1.2.7 PEG介导灰葡萄孢原生质体转化
            1.2.8 灰葡萄孢敲除转化子的验证策略
            1.2.9 灰葡萄孢敲除转化子的单孢纯化
            1.2.10 高盐法提取灰葡萄孢基因组DNA
            1.2.11 Southern blot分析
            1.2.12 灰葡萄孢菌丝生长速度的测定
            1.2.13 灰葡萄孢菌落形态和的观察
            1.2.14 灰葡萄孢产酸能力的定性测定
            1.2.15 灰葡萄孢菌核形成的测定
            1.2.16 灰葡萄孢致病力的测定
    2 结果与分析
        2.1 灰葡萄孢菌核形成相关候选基因的选择
        2.2 灰葡萄孢菌核形成相关候选基因的表达模式分析
            2.2.1 候选基因在菌核形成阶段的表达模式
            2.2.2 候选基因在致病阶段的表达模式
        2.3 灰葡萄孢菌核形成相关候选基因敲除转化子的获得
            2.3.1 候选基因敲除载体的构建
            2.3.2 PEG介导原生质体转化
            2.3.3 菌核形成相关候选基因敲除转化子的验证
            2.3.4 敲除转化子的单孢纯化及PCR验证
            2.3.5 灰葡萄孢基因敲除转化子的Southern blot验证
        2.4 灰葡萄孢菌核形成相关候选基因敲除转化子的生物学特性研究
            2.4.1 候选基因敲除转化子的菌落形态观察
            2.4.2 候选基因敲除转化子生长速度的测定
            2.4.3 候选基因敲除转化子菌核形成能力的测定
            2.4.4 候选基因敲除转化子致病力的测定
            2.4.5 灰葡萄孢基因敲除转化子产酸的定性测定
    3 结论与讨论
第四章 枯草杆菌蛋白酶类似蛋白酶的功能研究
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 试验菌株
            1.1.2 培养基
        1.2 试验方法
            1.2.1 灰葡萄孢基因Bcser2的敲除
            1.2.2 灰葡萄孢基因Bcser2的互补试验
            1.2.3 灰葡萄孢菌核形成的测定
            1.2.4 灰葡萄孢致病力的测定
            1.2.5 灰葡萄孢侵染结构的观察
            1.2.6 灰葡萄孢在逆境条件下的生长测定
            1.2.7 灰葡萄孢菌丝尖端观察
    2 结果与分析
        2.1 灰葡萄孢Bcser1和Bcser2蛋白结构分析
        2.2 灰葡萄孢Bcser1和Bcser2基因表达模式
        2.3 灰葡萄孢基因Bcser2的敲除及Bcser1和Bcser2的双敲除
        2.4 灰葡萄孢基因Bcser2的互补试验
        2.5 基因Bcser1和Bcser2转化子的生物学特性
        2.6 基因Bcser2参与灰葡萄孢分生孢子的形成
        2.7 基因Bcser2参与灰葡萄孢菌核的形成
        2.8 基因Bcser2在灰葡萄孢致病力过程中发挥重要作用
        2.9 基因Bcser2参与灰葡萄孢侵染垫的形成
        2.10 基因Bcser2参与灰葡萄孢对pH胁迫的耐受作用
    3 结论与讨论
第五章 结论与展望
    1 全文结论
    2 研究展望
参考文献
附录1
附录2
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]番茄灰霉病生物防治的研究进展[J]. 马晨,周欣玥,王全.  园艺与种苗. 2018(02)
[2]番茄灰霉病防治研究进展[J]. 纪军建,张小风,王文桥,张金林.  中国农学通报. 2012(31)
[3]葡萄灰霉病研究进展[J]. 陈宇飞,文景芝,李立军.  东北农业大学学报. 2006(05)
[4]国内保护地蔬菜灰霉病侵染规律及防治技术研究进展[J]. 杨燕涛.  农药. 2003(01)



本文编号：3179596