Atg6对棉铃虫繁殖的影响及其在昆虫细胞自噬中的作用
发布时间：2021-06-10 20:38
细胞自噬（Autophagy）是广泛存在于真核生物中的一种溶酶体对细胞内自身结构进行吞噬和降解的现象。它既是细胞的一种自我保护机制,在一定条件下细胞自噬程序性死亡也是一种区别于细胞凋亡的Ⅱ型程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）,因此具有重要的生物学功能。它参与生物个体的发育、疾病的发生、个体的衰老和细胞分化,同时也在生物体度过恶劣环境、抵御病原微生物等过程中发挥重要作用。Atg6 （autophagy-related-gene-6）是细胞自噬过程中的重要调节分子,具有自噬守门者之称,在哺乳动物细胞中具有非常重要的生理功能。白噬相关蛋白Atg8定位于自噬体膜,在细胞发生自噬的过程中随同自噬体一同进入液泡而被降解,因此常常作为研究细胞自噬的标记物。棉铃虫（Helicoverpa armigera）,鳞翅目夜蛾科昆虫的一种,是我国的重要害虫之一,对农作物造成了严重的危害。但目前有关Atg6对昆虫细胞自噬的调节及棉铃虫Atg6基因对昆虫生长发育的影响研究还尚未见报。本研究通过RNA干扰技术使棉铃虫Atg6基因表达沉默,以探究该基因的沉默对虫体生长发育的影响。首...
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一部分 前言
1.1 细胞自噬简介
1.1.1 细胞自噬的概念和分类
1.1.2 细胞自噬的发生过程
1.1.3 细胞自噬的特性
1.1.4 细胞自噬与细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)
1.2 细胞自噬发生的分子机制
1.2.1 自噬相关基因与相关蛋白
1.2.2 自噬发生的分子机制
1.2.3 自噬相关基因Atg6(Autophagy-related-gene-6)
1.3 棉铃虫简介
1.4 本课题研究目的与意义
第二部分 实验材料
2.1 细胞系和细胞培养基
2.2 质粒和菌株
2.3 实验动物
2.3.1 棉铃虫
2.3.2 小鼠
2.4 主要实验药品与试剂
2.5 常用溶液及其配制
2.5.1 碱裂解法提取质粒DNA所用溶液
2.5.2 PBS(磷酸盐缓冲液)
2.5.3 5×TBE
2.5.4 转染用无血清Grace's
2.5.5 蛋白质凝胶电泳所用溶液
2.5.6 蛋白免疫印迹(Western Blo)相关的溶液
2.5.7 蛋白质凝胶的配制
2.5.8 卡那霉素(Kanamycin)与氨苄青霉素(Ampicillin)
2.6 常用培养基的配制
2.6.1 昆虫Grace's Insect Cell Culture Medium
2.6.2 液体LB培养基
2.6.3 固体LB培养基
2.6.4 棉铃虫人工饲料的配制
2.7 主要实验仪器与型号
2.8 实验中用到引物的名称和及其引物序列
第三部分 实验方法
3.1 棉铃虫自噬相关基因Atg6干扰片段的克隆
3.1.1 棉铃虫Atg6的基因序列分析
3.1.2 棉铃虫Atg6基因RNA干扰片段选取
3.1.3 干扰片段的扩增
3.2 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰片段的克隆
3.2.1 用clustalx软件比对家蚕Atg6和棉铃虫细胞Ha-Atg6的ORF
3.2.2 干扰片段的选取和目的基因的扩增
3.3 棉铃虫四龄幼虫中肠的解剖和冻存
3.4 棉铃虫中肠总RNA的提取
3.5 Ha-Atg6 cDNA的合成
3.5.1 基因组DNA的去除
3.5.2 cDNA的合成
3.6 dsRNA注射棉铃虫
3.7 实时荧光定量PCR反应体系
3.8 棉铃虫生长繁殖指标统计
3.9 dsRNA的合成
第四部分 实验结果
4.1 目的基因Atg6蛋白的表达和多克隆抗体的制备
4.2 不同昆虫细胞系中Atg6蛋白的差异表达
4.3 无血清培养条件下Bme细胞中Atg6蛋白表达的变化
4.4 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的RNA干扰和凋亡的关系研究
4.4.1 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰片段的扩增和dsRNA的合成
4.4.2 合成的TH-Atg6-dsRNA干扰效果的检测
4.4.3 TH-Atg6的RNA干扰和凋亡的关系
4.5 斜纹夜蛾TH细胞和粉纹夜蛾TnH_5细胞中Atg6基因的干扰对细胞自噬的影响研究
4.5.1 粉纹夜蛾细胞TnH_5-Atg6干扰片段的基因克隆及其dsRNA的合成
4.5.2 TH-Atg6-dsRNA和TnH_5-Atg6-dsRNA干扰效率的检测
4.5.3 斜纹夜蛾细胞TH和粉纹夜蛾细胞TnH5中Atg6基因的干扰对细胞自噬的影响研究(western-blot方法)
4.5.4 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰48h后Atg8转录子的相对定量结果
4.6 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的超表达对细胞自噬的影响
4.6.1 重组质粒转染效率的检测
4.6.2 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的超表达对细胞自噬的影响探究
4.7 棉铃虫Atg6基因进化树
4.8 棉铃虫自噬相关基因Atg6和对照GFP基因干扰片断的PCR扩增以及dsRNA的合成
4.9 棉铃虫Atg6-dsRNA沉默了Atg6基因的表达
4.9.1 荧光定量PCR产物特异性分析
4.9.2 棉铃虫四龄幼虫中肠组织中Atg6转录子的相对定量检测
4.10 棉铃虫Atg6基因沉默对其生长发育的影响
4.10.1 Ha-Atg6基因沉默对棉铃虫体重无显著影响
4.10.2 Atg6基因的沉默使棉铃虫产卵量下降
4.10.3 Atg6基因沉默使棉铃虫孵化率减小
4.11 qRT-PCR方法对棉铃虫Atg6干扰最适计量的探究
第五部分 讨论
5.1 Atg6介导的昆虫细胞自噬研究
5.2 Atg6对棉铃虫繁殖的影响研究
5.2.1 棉铃虫Atg6基因dsRNA注射虫体降低虫体内该基因mRNA水平
5.2.2 棉铃虫Atg6基因表达沉默使虫体繁殖能力下降
参考文献
硕士期间合作发表论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]雷帕霉素对二种鳞翅目昆虫细胞自噬和凋亡的影响[J]. 李佳芮,邓玉杰,张许平,付涛,马源,郭建军,刘凯于. 昆虫知识. 2009(03)
[2]昆虫细胞程序性死亡的研究进展[J]. 刘凯于,邓玉杰,张许平,彭建新,李毅,洪华珠. 昆虫学报. 2008(06)
本文编号：3223084
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一部分 前言
1.1 细胞自噬简介
1.1.1 细胞自噬的概念和分类
1.1.2 细胞自噬的发生过程
1.1.3 细胞自噬的特性
1.1.4 细胞自噬与细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)
1.2 细胞自噬发生的分子机制
1.2.1 自噬相关基因与相关蛋白
1.2.2 自噬发生的分子机制
1.2.3 自噬相关基因Atg6(Autophagy-related-gene-6)
1.3 棉铃虫简介
1.4 本课题研究目的与意义
第二部分 实验材料
2.1 细胞系和细胞培养基
2.2 质粒和菌株
2.3 实验动物
2.3.1 棉铃虫
2.3.2 小鼠
2.4 主要实验药品与试剂
2.5 常用溶液及其配制
2.5.1 碱裂解法提取质粒DNA所用溶液
2.5.2 PBS(磷酸盐缓冲液)
2.5.3 5×TBE
2.5.4 转染用无血清Grace's
2.5.5 蛋白质凝胶电泳所用溶液
2.5.6 蛋白免疫印迹(Western Blo)相关的溶液
2.5.7 蛋白质凝胶的配制
2.5.8 卡那霉素(Kanamycin)与氨苄青霉素(Ampicillin)
2.6 常用培养基的配制
2.6.1 昆虫Grace's Insect Cell Culture Medium
2.6.2 液体LB培养基
2.6.3 固体LB培养基
2.6.4 棉铃虫人工饲料的配制
2.7 主要实验仪器与型号
2.8 实验中用到引物的名称和及其引物序列
第三部分 实验方法
3.1 棉铃虫自噬相关基因Atg6干扰片段的克隆
3.1.1 棉铃虫Atg6的基因序列分析
3.1.2 棉铃虫Atg6基因RNA干扰片段选取
3.1.3 干扰片段的扩增
3.2 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰片段的克隆
3.2.1 用clustalx软件比对家蚕Atg6和棉铃虫细胞Ha-Atg6的ORF
3.2.2 干扰片段的选取和目的基因的扩增
3.3 棉铃虫四龄幼虫中肠的解剖和冻存
3.4 棉铃虫中肠总RNA的提取
3.5 Ha-Atg6 cDNA的合成
3.5.1 基因组DNA的去除
3.5.2 cDNA的合成
3.6 dsRNA注射棉铃虫
3.7 实时荧光定量PCR反应体系
3.8 棉铃虫生长繁殖指标统计
3.9 dsRNA的合成
第四部分 实验结果
4.1 目的基因Atg6蛋白的表达和多克隆抗体的制备
4.2 不同昆虫细胞系中Atg6蛋白的差异表达
4.3 无血清培养条件下Bme细胞中Atg6蛋白表达的变化
4.4 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的RNA干扰和凋亡的关系研究
4.4.1 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰片段的扩增和dsRNA的合成
4.4.2 合成的TH-Atg6-dsRNA干扰效果的检测
4.4.3 TH-Atg6的RNA干扰和凋亡的关系
4.5 斜纹夜蛾TH细胞和粉纹夜蛾TnH_5细胞中Atg6基因的干扰对细胞自噬的影响研究
4.5.1 粉纹夜蛾细胞TnH_5-Atg6干扰片段的基因克隆及其dsRNA的合成
4.5.2 TH-Atg6-dsRNA和TnH_5-Atg6-dsRNA干扰效率的检测
4.5.3 斜纹夜蛾细胞TH和粉纹夜蛾细胞TnH5中Atg6基因的干扰对细胞自噬的影响研究(western-blot方法)
4.5.4 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6干扰48h后Atg8转录子的相对定量结果
4.6 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的超表达对细胞自噬的影响
4.6.1 重组质粒转染效率的检测
4.6.2 斜纹夜蛾细胞TH-Atg6的超表达对细胞自噬的影响探究
4.7 棉铃虫Atg6基因进化树
4.8 棉铃虫自噬相关基因Atg6和对照GFP基因干扰片断的PCR扩增以及dsRNA的合成
4.9 棉铃虫Atg6-dsRNA沉默了Atg6基因的表达
4.9.1 荧光定量PCR产物特异性分析
4.9.2 棉铃虫四龄幼虫中肠组织中Atg6转录子的相对定量检测
4.10 棉铃虫Atg6基因沉默对其生长发育的影响
4.10.1 Ha-Atg6基因沉默对棉铃虫体重无显著影响
4.10.2 Atg6基因的沉默使棉铃虫产卵量下降
4.10.3 Atg6基因沉默使棉铃虫孵化率减小
4.11 qRT-PCR方法对棉铃虫Atg6干扰最适计量的探究
第五部分 讨论
5.1 Atg6介导的昆虫细胞自噬研究
5.2 Atg6对棉铃虫繁殖的影响研究
5.2.1 棉铃虫Atg6基因dsRNA注射虫体降低虫体内该基因mRNA水平
5.2.2 棉铃虫Atg6基因表达沉默使虫体繁殖能力下降
参考文献
硕士期间合作发表论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]雷帕霉素对二种鳞翅目昆虫细胞自噬和凋亡的影响[J]. 李佳芮,邓玉杰,张许平,付涛,马源,郭建军,刘凯于. 昆虫知识. 2009(03)
[2]昆虫细胞程序性死亡的研究进展[J]. 刘凯于,邓玉杰,张许平,彭建新,李毅,洪华珠. 昆虫学报. 2008(06)
本文编号：3223084
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/nykj/3223084.html
