葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因的克
发布时间：2021-08-14 17:00
葡萄根瘤蚜Daktulosphaira vitifoliae（Fitch）（半翅目:根瘤蚜科）是一种世界性分布的单食性害虫,只危害葡萄属植物,也是我国重要的植物检疫性有害生物之一,可对葡萄造成毁灭性危害。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是好氧生物中一类重要的多功能酶,主要参与内源性和外源性化合物的解毒,还参与细胞内转运、激素生物合成和抗氧化应激保护。深入研究葡萄根瘤蚜体内GSTs基因的功能对于干扰其解毒过程的害虫治理手段具有深远意义。本文以葡萄根瘤蚜为研究对象,对其谷胱甘肽S-转移酶进行基因克隆获得了7个胞质型Dvi GSTs,并在此基础上进行了原核表达、蛋白纯化、重组蛋白的酶动力学参数测定、抗氧化能力检测以及农药对重组蛋白的离体抑制测定,主要研究结果如下:1、基因克隆:克隆获得了7个胞质型Dvi GSTs,分别为Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTt1、Dvi GSTo1、Dvi GSTs1、Dvi GSTs2和Dvi GSTs3,分属于四个不同的家族,即Delta、Theta、Omega和Sigma,经测序验证各基因的序列与NCBI中序列一致。7个GSTs基因开放阅...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
昆虫GSTs与人类PiGST的比较（Kettermanetal.2011）
西北农林科技大学硕士学位论文81.3.3谷胱甘肽S-转移酶的功能概述GSTs是绝大多数生物体中发现的第二阶段解毒酶的一个主要家族，其抗药性的主要机制如图1-2所示。第一种情况是GSTs催化底物GSH与杀虫剂进行结合，产生毒性较小的可溶性结合物（图1-2a）。第二种情况是GSTs参与DDT的解毒过程，主要形式为以GSH作为协同因子，共同催化DDT，将其直接代谢为无毒的DDE（图1-2b）。在图1-2c中是第三种情况，昆虫摄入杀虫剂后会引起氧化应激反应，GSTs可显示过氧化物酶活性，从而减少该反应过程中产生有毒的过氧化物。同时GSTs也可通过杀虫剂的非催化被动结合产生抗性（图1-2d）。在昆虫的整个解毒过程中GSTs参与的代谢抗性分为两种情况：直接代谢和间接代谢，其中间接代谢是指代谢由其他解毒酶（如P450s和CCEs）产生的次级产物。该酶最著名的是谷胱甘肽（GSH）偶联反应，它们能催化亲电的内源和外源化合物与谷胱甘肽（GSH）的巯基结合，这中和了化学物质的高活性亲核位点，增加了产物的水溶性，从而促进了它从细胞中的排泄（Pavlidietal.2018）。由于GSH存在于高浓度的细胞内，GSTs的GSH结合位点可能总是被占据，但N-末端结构域中的“活性位点残基”能与谷胱甘肽的巯基相互作用并激活巯基，因此GSTs对GSH有很高的亲和力。在大多数哺乳动物GSTs中，活性位点残基是酪氨酸，但在Delta和Epsilon昆虫GSTs中，这种作用是由丝氨酸残基执行的（Enayatietal.2005）。图1-2GSTs介导的抗药性的主要机制（Pavlidietal.2018）Fig1-2ThemainmechanismofGSTs-mediatedresistance（Pavlidietal.2018）
西北农林科技大学硕士学位论文28bpMWbpMd1d2t1o1s1s2s320001000750500250100第三章结果与分析3.1葡萄根瘤蚜GSTs基因克隆3.1.1总RNA提取结果检测成功从葡萄根瘤蚜成虫体内提取得到总RNA（图3-1）。经过1%琼脂糖凝胶电泳的检测，可清晰地见到该RNA的28S，18S和5S三条条带完整且明亮，并检测OD260/280值约为1.9。图3-1葡萄根瘤蚜成虫总RNA提取电泳图M：DNA分子量标准,W：全虫Fig.3-1TheRNAoftissuesextractedfromD.vitifoliaeM：DNAMarker,W：Wholeinsect3.1.2葡萄根瘤蚜GSTs基因cDNA片段的克隆以葡萄根瘤蚜成虫的cDNA为模板，并使用特异性引物对葡萄根瘤蚜DviGSTd1、DviGSTd2、DviGSTt1、DviGSTo1、DviGSTs1、DviGSTs2和DviGSTs3的开放阅读框进行PCR扩增，将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图3-2），结果显示DviGSTs基因约在600-750bp处有明显的目的条带，与GenBank中发布的葡萄根瘤蚜GSTs基因的核苷酸序列长度基本一致。图3-2葡萄根瘤蚜GSTs基因片段的扩增结果Fig3-2AmplificationresultoftheDviGSTsgenefragment
【参考文献】：
期刊论文
[1]Effects of intercropping vines with tobacco and root extracts of tobacco on grape phylloxera, Daktulosphaira vitifoliae Fitch[J]. WANG Zhong-yue,SU Jun-ping,LIU Wei-wei,GUO Yu-yuan. Journal of Integrative Agriculture. 2015(07)
[2]葡萄根瘤蚜生物型和遗传多样性研究进展[J]. 孙庆华,杜远鹏,王兆顺,翟衡. 果树学报. 2012(01)
[3]上海地区发现葡萄根瘤蚜危害[J]. 叶军,郑建中,唐国良. 植物检疫. 2006(02)
博士论文
[1]葡萄根瘤蚜嗅觉相关蛋白的鉴定与功能研究[D]. 赵晶晶.西北农林科技大学 2018
[2]梨小食心虫识别寄主植物挥发物的分子机制[D]. 李广伟.西北农林科技大学 2016
[3]棉铃虫嗅觉相关蛋白的鉴定及功能研究[D]. 张天涛.西北农林科技大学 2011
本文编号：3342843
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
昆虫GSTs与人类PiGST的比较（Kettermanetal.2011）
西北农林科技大学硕士学位论文81.3.3谷胱甘肽S-转移酶的功能概述GSTs是绝大多数生物体中发现的第二阶段解毒酶的一个主要家族，其抗药性的主要机制如图1-2所示。第一种情况是GSTs催化底物GSH与杀虫剂进行结合，产生毒性较小的可溶性结合物（图1-2a）。第二种情况是GSTs参与DDT的解毒过程，主要形式为以GSH作为协同因子，共同催化DDT，将其直接代谢为无毒的DDE（图1-2b）。在图1-2c中是第三种情况，昆虫摄入杀虫剂后会引起氧化应激反应，GSTs可显示过氧化物酶活性，从而减少该反应过程中产生有毒的过氧化物。同时GSTs也可通过杀虫剂的非催化被动结合产生抗性（图1-2d）。在昆虫的整个解毒过程中GSTs参与的代谢抗性分为两种情况：直接代谢和间接代谢，其中间接代谢是指代谢由其他解毒酶（如P450s和CCEs）产生的次级产物。该酶最著名的是谷胱甘肽（GSH）偶联反应，它们能催化亲电的内源和外源化合物与谷胱甘肽（GSH）的巯基结合，这中和了化学物质的高活性亲核位点，增加了产物的水溶性，从而促进了它从细胞中的排泄（Pavlidietal.2018）。由于GSH存在于高浓度的细胞内，GSTs的GSH结合位点可能总是被占据，但N-末端结构域中的“活性位点残基”能与谷胱甘肽的巯基相互作用并激活巯基，因此GSTs对GSH有很高的亲和力。在大多数哺乳动物GSTs中，活性位点残基是酪氨酸，但在Delta和Epsilon昆虫GSTs中，这种作用是由丝氨酸残基执行的（Enayatietal.2005）。图1-2GSTs介导的抗药性的主要机制（Pavlidietal.2018）Fig1-2ThemainmechanismofGSTs-mediatedresistance（Pavlidietal.2018）
西北农林科技大学硕士学位论文28bpMWbpMd1d2t1o1s1s2s320001000750500250100第三章结果与分析3.1葡萄根瘤蚜GSTs基因克隆3.1.1总RNA提取结果检测成功从葡萄根瘤蚜成虫体内提取得到总RNA（图3-1）。经过1%琼脂糖凝胶电泳的检测，可清晰地见到该RNA的28S，18S和5S三条条带完整且明亮，并检测OD260/280值约为1.9。图3-1葡萄根瘤蚜成虫总RNA提取电泳图M：DNA分子量标准,W：全虫Fig.3-1TheRNAoftissuesextractedfromD.vitifoliaeM：DNAMarker,W：Wholeinsect3.1.2葡萄根瘤蚜GSTs基因cDNA片段的克隆以葡萄根瘤蚜成虫的cDNA为模板，并使用特异性引物对葡萄根瘤蚜DviGSTd1、DviGSTd2、DviGSTt1、DviGSTo1、DviGSTs1、DviGSTs2和DviGSTs3的开放阅读框进行PCR扩增，将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图3-2），结果显示DviGSTs基因约在600-750bp处有明显的目的条带，与GenBank中发布的葡萄根瘤蚜GSTs基因的核苷酸序列长度基本一致。图3-2葡萄根瘤蚜GSTs基因片段的扩增结果Fig3-2AmplificationresultoftheDviGSTsgenefragment
【参考文献】：
期刊论文
[1]Effects of intercropping vines with tobacco and root extracts of tobacco on grape phylloxera, Daktulosphaira vitifoliae Fitch[J]. WANG Zhong-yue,SU Jun-ping,LIU Wei-wei,GUO Yu-yuan. Journal of Integrative Agriculture. 2015(07)
[2]葡萄根瘤蚜生物型和遗传多样性研究进展[J]. 孙庆华,杜远鹏,王兆顺,翟衡. 果树学报. 2012(01)
[3]上海地区发现葡萄根瘤蚜危害[J]. 叶军,郑建中,唐国良. 植物检疫. 2006(02)
博士论文
[1]葡萄根瘤蚜嗅觉相关蛋白的鉴定与功能研究[D]. 赵晶晶.西北农林科技大学 2018
[2]梨小食心虫识别寄主植物挥发物的分子机制[D]. 李广伟.西北农林科技大学 2016
[3]棉铃虫嗅觉相关蛋白的鉴定及功能研究[D]. 张天涛.西北农林科技大学 2011
本文编号：3342843
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