稻瘟病菌分泌途径相关基因MoSec4功能分析
发布时间：2021-12-29 06:46
囊泡运输包括胞吞途径和分泌途径,是真核生物中普遍存在的特有的蛋白运输方式。作为重要的转运蛋白,Rab家族蛋白在囊泡的形成与转运起着重要的调节作用。酵母Rab家族蛋白成员之一 Sec4在分泌囊泡从高尔基体到质膜融合中起作用,调节囊泡分泌蛋白至胞外。在病原真菌与植物相互识别及其侵染过程中,分泌到胞外的效应子,是引致植物病害过程所必须的。因此研究稻瘟病菌中Sec4同源蛋白的功能十分重要。本研究分别通过生物化学与分子遗传学,细胞生物学及植物病理学的方法研究了稻瘟病菌MoSec4在生长发育及致病性中的作用,结果显示,MoSec4的缺失导致稻瘟病菌生长速率有所下降,产孢量显著下降,同时孢子变长,对细胞壁敏感剂如刚果红、SDS、过氧化氢等敏感性增强,附着胞膨压受影响,对感病水稻品种毒力下降;进一步分析发现,MoSec4缺失突变体显示出对内质网ER抑制剂更敏感,分泌至胞外的水解酶如蔗糖酶、淀粉酶、纤维素酶、漆酶等变少,突变体无法激发具相应抗病基因水稻品种Pid3、Pi9及Pib产生HR反应,ROS的产生减少,防卫基因OsPR1a、OsPAL、OsPBZ1在侵染水稻48至72h后表达量比野生型更高;将细...
【文章来源】： 福建农林大学福建省
【文章页数】：62 页
【文章目录】：
摘要
Abstract
一 引言
1 真核生物囊泡运输机制及其调控因子
1.1 囊泡运输概况
1.2 囊泡运输路径:胞吞途径和分泌途径
1.3 胞吞和分泌途径相关的蛋白调控因子及其作用
1.3.1 Rab蛋白在囊泡运输中的作用
1.3.1.1 Rab蛋白
1.3.1.2 分泌途径相关基因Sec4
1.3.2 粘附因子在囊泡运输中的作用
1.3.2.1 粘附因子
1.3.2.2 Sec4下游组件分泌复合物
1.3.3 其他蛋白家族在囊泡运输中的作用
1.3.3.1 包被蛋白复合物
1.3.3.2 SNARE蛋白
1.3.3.3 SM蛋白家族
2 病原菌与植物互作防御机制
2.1 病原菌与植物互作时的防御机制PTI和ETI
2.2 效应子及其在植物与病原物互作中的作用
3 稻瘟病菌及其效应子在囊泡运输中的转运机制
3.1 稻瘟病的危害和侵染机制
3.2 稻瘟病菌效应子及其转运分泌机制
3.3 研究稻瘟病菌Sec4同源基因在效应因子转运机制中作用的意义
二 材料与方法
1 实验材料
1.1 供试菌株
1.2 供试质粒
1.3 供试植物
1.4 生化试剂
1.5 培养基
2 实验方法
2.1 Sec4同源蛋白的获得和结构域分析
2.2 融合蛋白AvrPizt-mcherry、BAS4-GFP、Spa2-mcherry、Sec4-GFP构建
2.2.1 供试载体
2.2.2 融合蛋白的构建
2.2.3 转化子的筛选与验证
2.2.3.1 PCR反应体系
2.2.3.2 质粒提取和稻瘟病菌原生质体制备与转化
2.2.3.3 转化子DNA提取和验证
2.3 Quantitative RT-PCR分析基因表达量
2.3.1 水稻RNA的提取
2.3.2 RNA的反转录
2.3.3 荧光实时定量PCR
2.4 酶活测定
2.5 基本表型分析(所有实验设置三次独立重复生物学重复)
2.5.1 菌落生长速率测定
2.5.2 菌丝和菌丝体形态分析
2.5.3 稻瘟病菌产孢量统计
2.5.4 孢子形态观察和隔膜染色
2.5.5 稻瘟病菌分生孢子梗观察
2.5.6 孢子萌发率、附着胞形成率统计及附着胞的塌陷情况分析
2.5.7 ER和细胞壁敏感性分析
2.5.8 不同碳源下的生长情况分析
2.5.9 洋葱表皮侵染实验
2.5.10 致病性分析
2.5.11 稻瘟病菌叶鞘接种以及DAB染色实验
2.5.12 AvrPizt-mcherry、BAS4-GFP、Spa2-mcherry及Sec4-GFP荧光观察
三 结果与分析
1 稻瘟病菌MoSec4获得和氨基酸系列保守性分析
2 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌生长和孢子形态建成
2.1 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌生长
2.2 MoSec4的缺失影响细胞壁敏感性
2.3 MoSec4的缺失影响分生孢子的形成
3 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌的毒力
4 MoSec4的缺失对ER抑制剂更敏感
5 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌胞外酶分泌
6 MoSec4是稻瘟病菌分泌效应蛋白所必须的
7 MoSec4影响细胞质效应子AvrPiz-t分泌和BIC的形成
8 MoSec4一定程度上影响了非质原效应子BSA4的分泌
9 MoSec4可能通过调控下游组件在分泌途径中起作用
10 MoSec4可能介导内膜细胞器在分泌途径中起作用
四 小结与讨论
1 稻瘟病菌中Sec4同源基因存在结构保守性
2 MoSec4与稻瘟病菌生长发育相关
3 MoSec4参与稻瘟病菌分泌途径,影响稻瘟病菌毒力
4 MoSec4介导不同效应蛋白分泌,参与不同分泌途径
五 下一步研究内容
攻读硕士期间发表的论文
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rab蛋白的结构、功能与研究展望 [J]. 吴文林,吴穗洁. 台湾海峡. 2006(04)
硕士论文
[1]稻瘟病菌中一个假定的Rab族蛋白RAB8之功能分析[D]. 刘淑燕.福建农林大学. 2008
本文编号：3555610
【文章来源】： 福建农林大学福建省
【文章页数】：62 页
【文章目录】：
摘要
Abstract
一 引言
1 真核生物囊泡运输机制及其调控因子
1.1 囊泡运输概况
1.2 囊泡运输路径:胞吞途径和分泌途径
1.3 胞吞和分泌途径相关的蛋白调控因子及其作用
1.3.1 Rab蛋白在囊泡运输中的作用
1.3.1.1 Rab蛋白
1.3.1.2 分泌途径相关基因Sec4
1.3.2 粘附因子在囊泡运输中的作用
1.3.2.1 粘附因子
1.3.2.2 Sec4下游组件分泌复合物
1.3.3 其他蛋白家族在囊泡运输中的作用
1.3.3.1 包被蛋白复合物
1.3.3.2 SNARE蛋白
1.3.3.3 SM蛋白家族
2 病原菌与植物互作防御机制
2.1 病原菌与植物互作时的防御机制PTI和ETI
2.2 效应子及其在植物与病原物互作中的作用
3 稻瘟病菌及其效应子在囊泡运输中的转运机制
3.1 稻瘟病的危害和侵染机制
3.2 稻瘟病菌效应子及其转运分泌机制
3.3 研究稻瘟病菌Sec4同源基因在效应因子转运机制中作用的意义
二 材料与方法
1 实验材料
1.1 供试菌株
1.2 供试质粒
1.3 供试植物
1.4 生化试剂
1.5 培养基
2 实验方法
2.1 Sec4同源蛋白的获得和结构域分析
2.2 融合蛋白AvrPizt-mcherry、BAS4-GFP、Spa2-mcherry、Sec4-GFP构建
2.2.1 供试载体
2.2.2 融合蛋白的构建
2.2.3 转化子的筛选与验证
2.2.3.1 PCR反应体系
2.2.3.2 质粒提取和稻瘟病菌原生质体制备与转化
2.2.3.3 转化子DNA提取和验证
2.3 Quantitative RT-PCR分析基因表达量
2.3.1 水稻RNA的提取
2.3.2 RNA的反转录
2.3.3 荧光实时定量PCR
2.4 酶活测定
2.5 基本表型分析(所有实验设置三次独立重复生物学重复)
2.5.1 菌落生长速率测定
2.5.2 菌丝和菌丝体形态分析
2.5.3 稻瘟病菌产孢量统计
2.5.4 孢子形态观察和隔膜染色
2.5.5 稻瘟病菌分生孢子梗观察
2.5.6 孢子萌发率、附着胞形成率统计及附着胞的塌陷情况分析
2.5.7 ER和细胞壁敏感性分析
2.5.8 不同碳源下的生长情况分析
2.5.9 洋葱表皮侵染实验
2.5.10 致病性分析
2.5.11 稻瘟病菌叶鞘接种以及DAB染色实验
2.5.12 AvrPizt-mcherry、BAS4-GFP、Spa2-mcherry及Sec4-GFP荧光观察
三 结果与分析
1 稻瘟病菌MoSec4获得和氨基酸系列保守性分析
2 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌生长和孢子形态建成
2.1 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌生长
2.2 MoSec4的缺失影响细胞壁敏感性
2.3 MoSec4的缺失影响分生孢子的形成
3 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌的毒力
4 MoSec4的缺失对ER抑制剂更敏感
5 MoSec4的缺失影响稻瘟病菌胞外酶分泌
6 MoSec4是稻瘟病菌分泌效应蛋白所必须的
7 MoSec4影响细胞质效应子AvrPiz-t分泌和BIC的形成
8 MoSec4一定程度上影响了非质原效应子BSA4的分泌
9 MoSec4可能通过调控下游组件在分泌途径中起作用
10 MoSec4可能介导内膜细胞器在分泌途径中起作用
四 小结与讨论
1 稻瘟病菌中Sec4同源基因存在结构保守性
2 MoSec4与稻瘟病菌生长发育相关
3 MoSec4参与稻瘟病菌分泌途径,影响稻瘟病菌毒力
4 MoSec4介导不同效应蛋白分泌,参与不同分泌途径
五 下一步研究内容
攻读硕士期间发表的论文
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rab蛋白的结构、功能与研究展望 [J]. 吴文林,吴穗洁. 台湾海峡. 2006(04)
硕士论文
[1]稻瘟病菌中一个假定的Rab族蛋白RAB8之功能分析[D]. 刘淑燕.福建农林大学. 2008
本文编号：3555610
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/nykj/3555610.html
