利用昆虫免疫负调控因子serpin提高球孢白僵菌毒力

发布时间：2021-12-30 08:02

　　昆虫病原真菌具有对环境无害、寄主范围广、可在适当时候形成流行病等特点,已被广泛应用于农林害虫及城市卫生昆虫的生物防治。但其致死宿主速度慢（4-14d）、对环境条件要求高等缺点严重制约了真菌杀虫剂的推广和应用。真菌致病昆虫的过程包括孢子附着昆虫体壁、侵染结构形成、菌丝穿透体壁、真菌在宿主血腔中增殖并击倒宿主几个步骤。在此过程中,昆虫会利用其免疫系统进行积极的防御,产生吞噬、黑化及抗菌肽合成等免疫反应,抑制及清除入侵的病原物。研究表明,Toll信号途径是昆虫应对真菌侵染的主要信号通路。当真菌侵染宿主时,会激活体内的Spaetzle蛋白,进而活化Toll受体,引起相应的免疫反应。该信号途径受到丝氨酸蛋白酶抑制子（serpin）的负调控。在果蝇中,当缺乏serpin （Spn43Ac）时,会引起Toll介导免疫反应的组成性活化。因此,我们设想,将免疫负调控因子serpin导入到昆虫病原真菌中表达,使其在真菌侵染宿主的过程中抑制宿主的免疫反应,提高真菌在宿主中的增殖速度,从而增强真菌的杀虫效果。为此,课题组克隆了果蝇的Spn43Ac基因,构建了相应的真菌表达载体,经遗传转化后获得了球孢白僵菌Bb... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 昆虫病原真菌的研究概况
    1.2 昆虫病原真菌的改良及应用
        1.2.1 提高昆虫病原真菌杀虫毒力
        1.2.2 提高昆虫病原真菌的抗逆性
        1.2.3 改变昆虫病原真菌的寄主范围
    1.3 Serpin蛋白超家族的研究进展
        1.3.1 简介
        1.3.2 Serpin的结构特点
        1.3.3 Serpin的生物学功能
    1.4 Serpin在昆虫先天免疫系统中的功能
        1.4.1 昆虫先天免疫应答
        1.4.2 先天性免疫信号通路
        1.4.3 酚氧化酶(PO)级联系统介导的昆虫黑化反应
    1.5 研究目的和意义
第二章 引言
    2.1 研究背景和意义
    2.2 技术路线
第三章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 供试菌株
        3.1.2 生测用虫
        3.1.3 质粒载体
        3.1.4 主要化学试剂
        3.1.5 主要仪器设备
        3.1.6 主要缓冲液与配方
        3.1.7 主要培养基
        3.1.8 实验中使用的引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 Bbsp：Spn43Ac基因超量表达载体的构建
        3.2.2 大肠杆菌的转化
        3.2.3 农杆菌感受态细胞的制备及转化
        3.2.4 农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化
        3.2.5 Bbsp：Spn43Ac超量表达菌株的筛选
        3.2.6 Bbsp：Spn43Ac基因表达检测
        3.2.7 Bbsp：Spn43Ac-1菌株菌落形态的观察
        3.2.8 观察Bbsp：Spn43Ac-1菌株在蝉翅上的生长
        3.2.9 毒力测定
        3.2.10 检测Bbsp：Spn43Ac-1菌株在试虫血淋巴中虫菌体的增殖
        3.2.11 原核表达蛋白pGEX-6p-Spn43Ac载体的构建
        3.2.12 GST：Spn43Ac蛋白的原核表达及纯化
        3.2.13 Western Blot
        3.2.14 CDEP-1毕赤酵母的诱导表达
        3.2.15 检测GST：Spn43Ac蛋白对蛋白酶CDEP-1的影响
        3.2.16 昆虫血淋巴内酚氧化酶(PO)的酶活测定
        3.2.17 检测GST：Spn43Ac蛋白对酚氧化酶(PO)活性的影响
        3.2.18 统计分析
第四章 结果与分析
    4.1 Bbsp：Spn43Ac基因的真菌表达载体构建
    4.2 超量表达Bbsp：Spn43Ac转化子的筛选
    4.3 Spn43Ac在转化子中的表达分析
    4.4表达Bbsp:Spn43Ac不会影响真菌的生长
        4.4.1 Bbsp：Spn43Ac-1菌株的表型分析
        4.4.2 表达Bbsp：Spn43Ac不会影响真菌在蝉翅上的萌发及生长
        4.4.3 GST：Spn43Ac蛋白不会影响昆虫体壁降解酶CDEP-1的活性
    4.5 Bbsp:Spn43Ac-1菌株毒力测定结果
    4.6 真菌在昆虫血淋巴中的增殖
    4.7 昆虫血淋巴内酚氧化酶(PO)的酶活测定
    4.8 GST：Spn43Ac蛋白对酚氧化酶(PO)活性的影响
第五章 讨论
    5.1 表达Bbsp：Spn43Ac提高球孢白僵菌毒力
    5.2 表达Bbsp：Spn43Ac不会影响菌株的萌发和生长
    5.3 表达Spn43Ac抑制昆虫酚氧化酶活性
第六章 结论
参考文献
附录1 英文缩写
附录2 在读期间获得的成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]昆虫酚氧化酶的研究进展[J]. 刘丽萍,奚耕思,王芳,刘晓明.  生命科学. 2013(04)
[2]基因工程改良在昆虫病原真菌中的应用[J]. 边强,王广君,张泽华,高松,农向群.  中国生物工程杂志. 2009(03)
[3]Toll-NF-κB信号途径及其介导的功能[J]. 杨玉荣,佘锐萍,梁宏德.  细胞生物学杂志. 2007(04)
[4]球孢白僵菌丝氨酸蛋白酶基因CDEP-1在毕赤酵母中的表达[J]. 范艳华,张永军,罗志兵,冯静,方卫国,裴炎.  菌物学报. 2006(01)

博士论文
[1]球孢白僵菌孢壁蛋白相关的耐热分子机理及其耐热性状的遗传改良[D]. 应盛华.浙江大学 2006
[2]球孢白僵菌降解寄主体壁的几丁质酶和蛋白酶的分子改良[D]. 范艳华.西南大学 2006



本文编号：3557792