LEF-10功能的研究及朊病毒状态的解除
发布时间：2022-01-05 05:18
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Ac MNPV）是杆状病毒的模式种,晚期表达因子LEF-10对病毒的复制是必需的,但其功能及调控机制尚不清楚。先前研究表明,LEF-1 0 蛋白具有朊病毒特性,是一个由杆状病毒编码的朊病毒。当LEF-10第21位的氨基酸残基由亮氨酸残基突变为丙氨酸残基后,显著影响其朊病毒状态并上调病毒晚期基因的表达。先前的酵母双杂交实验证实LEF-10与LEF-6、LEF-12和P47之间存在相互作用。本研究共分为两部分,第一部分采用荧光显微镜和流式细胞仪检测一系列LEF-1 0 突变体对LEF-1 0功能及其朊病毒状态的影响;第二部分通过AC-Seq、Pulldown和Bi FC技术,对LEF-10的功能进行探究。第一部分,本研究首先构建了异位回补突变体LEF-10的重组杆状病毒lef-10L21XBacmid,其中LEF-10的第21位氨基酸残基饱和突变为其它19种氨基酸残基。重组病毒转染昆虫细胞后,只有野生型、L21I、L21V、L21F、L21C、L21M、L21A七种重组病毒能产生有感染性的子代病毒粒子。同时,本研究构建了原位突变LEF-10...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
所示，尽管两种病毒粒子的结构相似并且都有类似的杆状核衣壳，但其囊膜的来源及囊膜蛋白的组成不同
4℃保存。2.2.2.2重组病毒lef-10L21XBacmid的感染（1）将Sf9细胞均匀铺入细胞培养皿中，细胞密度约为70％；（2）将20μLlef-10L21XBacmid重组病毒逐滴加至细胞培养皿中，28℃静置培养5-7天；（3）使用倒置荧光显微镜对感染结果进行拍照，收集病毒上清即病毒P1代，于4℃保存。2.3结果与分析2.3.1pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒的构建以pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒为模板，利用引物扩增可得到大小为226bp的目的片段。实际PCR扩增lef-10L21X片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物的片段大小与预期结果相符（图2-1A）。对测序正确的重组质粒pTriEx-LEF-10L21X-DsRed进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，质粒大小与预期结果相符(图2-1B)。图2-1构建pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒检测（A）lef-10L21X片段PCR结果；（B）pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒检测Fig.2-1ConstructionofpTriEx-LEF-10L21X-DsRedplasmid(A)Detectionoflef-10L21XfragmentPCR;(B)DetectionofpTriEx-LEF-10L21X-DsRedplasmids注：后文凝胶图样品以下文顺序为基准。Note:Thefollowinggelsamplesarebasedonthefollowingsequence.（A）M：DNAMarker;1~19：lef-10L21G、lef-10L21I、lef-10L21P、lef-10L21V、lef-10L21F、lef-10L21W、lef-10L21Y、lef-10L21D、lef-10L21E、lef-10L21R、lef-10L21H、lef-10L21K、lef-10L21S、lef-10L21T、lef-10L21C、lef-10L21M、lef-10L21N、lef-10L21Q、lef-10L21A;（B）M：DNAMarker;1~20:pTriEx-LEF-10L21G-DsRed、pTriEx-LEF-10L21I-DsRed、pTriEx-LEF-10L21P-DsRed、pTriEx-LEF-10L21V-DsRed、pTriEx-LEF-10L21F-DsRed、
西北农林科技大学硕士学位论文20图中右下角显示标尺，标尺大小：200μmFigure2-2Fluorescencemicroscopicobservationoftransfectionof20ectopicinsertionofrecombinantvirusesTherulerisshowninthelowerrightcornerofthepicture,therulersize:200μm2.3.3荧光显微镜法分析lef-10L21XBacmid的感染情况将20种重组病毒的P0代病毒感染Sf9细胞，感染5天后，经倒置荧光显微镜观察。如图2-3显示，只有lef-10WTBacmid、lef-10L21IBacmid、lef-10L21ABacmid、lef-10L21FBacmid、lef-10L21CBacmid、lef-10L21MBacmid、lef-10L21VBacmid的7种异位回补重组病毒能产生红色荧光蛋白的荧光信号，其他13种异位回补重组病毒均无荧光信号。这表明只有LEF-10L21I、LEF-10L21V、LEF-10L21F、LEF-10L21C、LEF-10L21M、LEF-10L21A六种突变型LEF-10蛋白能功能性回补LEF-10蛋白。图2-3异位回补重组病毒的感染的荧光显微镜观察图中右下角显示标尺，标尺大小：200μmFigure2-3FluorescencemicroscopicobservationofectopicinsertionofrecombinantvirusinfectionsTherulerisshowninthelowerrightcornerofthepicture,therulersize:200μm
【参考文献】：
期刊论文
[1]测定杆状病毒滴度方法的研究进展[J]. 黄仕和,余模松. 微生物学免疫学进展. 2007(02)
本文编号：3569804
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
所示，尽管两种病毒粒子的结构相似并且都有类似的杆状核衣壳，但其囊膜的来源及囊膜蛋白的组成不同
4℃保存。2.2.2.2重组病毒lef-10L21XBacmid的感染（1）将Sf9细胞均匀铺入细胞培养皿中，细胞密度约为70％；（2）将20μLlef-10L21XBacmid重组病毒逐滴加至细胞培养皿中，28℃静置培养5-7天；（3）使用倒置荧光显微镜对感染结果进行拍照，收集病毒上清即病毒P1代，于4℃保存。2.3结果与分析2.3.1pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒的构建以pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒为模板，利用引物扩增可得到大小为226bp的目的片段。实际PCR扩增lef-10L21X片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物的片段大小与预期结果相符（图2-1A）。对测序正确的重组质粒pTriEx-LEF-10L21X-DsRed进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，质粒大小与预期结果相符(图2-1B)。图2-1构建pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒检测（A）lef-10L21X片段PCR结果；（B）pTriEx-LEF-10L21X-DsRed质粒检测Fig.2-1ConstructionofpTriEx-LEF-10L21X-DsRedplasmid(A)Detectionoflef-10L21XfragmentPCR;(B)DetectionofpTriEx-LEF-10L21X-DsRedplasmids注：后文凝胶图样品以下文顺序为基准。Note:Thefollowinggelsamplesarebasedonthefollowingsequence.（A）M：DNAMarker;1~19：lef-10L21G、lef-10L21I、lef-10L21P、lef-10L21V、lef-10L21F、lef-10L21W、lef-10L21Y、lef-10L21D、lef-10L21E、lef-10L21R、lef-10L21H、lef-10L21K、lef-10L21S、lef-10L21T、lef-10L21C、lef-10L21M、lef-10L21N、lef-10L21Q、lef-10L21A;（B）M：DNAMarker;1~20:pTriEx-LEF-10L21G-DsRed、pTriEx-LEF-10L21I-DsRed、pTriEx-LEF-10L21P-DsRed、pTriEx-LEF-10L21V-DsRed、pTriEx-LEF-10L21F-DsRed、
西北农林科技大学硕士学位论文20图中右下角显示标尺，标尺大小：200μmFigure2-2Fluorescencemicroscopicobservationoftransfectionof20ectopicinsertionofrecombinantvirusesTherulerisshowninthelowerrightcornerofthepicture,therulersize:200μm2.3.3荧光显微镜法分析lef-10L21XBacmid的感染情况将20种重组病毒的P0代病毒感染Sf9细胞，感染5天后，经倒置荧光显微镜观察。如图2-3显示，只有lef-10WTBacmid、lef-10L21IBacmid、lef-10L21ABacmid、lef-10L21FBacmid、lef-10L21CBacmid、lef-10L21MBacmid、lef-10L21VBacmid的7种异位回补重组病毒能产生红色荧光蛋白的荧光信号，其他13种异位回补重组病毒均无荧光信号。这表明只有LEF-10L21I、LEF-10L21V、LEF-10L21F、LEF-10L21C、LEF-10L21M、LEF-10L21A六种突变型LEF-10蛋白能功能性回补LEF-10蛋白。图2-3异位回补重组病毒的感染的荧光显微镜观察图中右下角显示标尺，标尺大小：200μmFigure2-3FluorescencemicroscopicobservationofectopicinsertionofrecombinantvirusinfectionsTherulerisshowninthelowerrightcornerofthepicture,therulersize:200μm
【参考文献】：
期刊论文
[1]测定杆状病毒滴度方法的研究进展[J]. 黄仕和,余模松. 微生物学免疫学进展. 2007(02)
本文编号：3569804
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