深绿木霉荧光蛋白标记体系构建及对西洋参根腐病的生防作用研究

发布时间：2022-09-17 10:04

　　西洋参根腐病作为土传病害,给西洋参的种植造成了严重影响。而木霉作为一种重要的生防真菌,在生物防治领域有重要的贡献。实验室前期研究中发现,深绿木霉（Trichoderma atroviride）HB20111对该病具有较好的防治效果。因此,本论文以深绿木霉为研究对象,一方面利用分子标签技术,改造深绿木霉菌株,使其成为我们“可视化”的工具。另一方面,通过高通量测序,从土壤微生物群落的角度,探究应用深绿木霉后对西洋参根际土壤微生物群落的影响,从生态学角度探究深绿木霉HB20111防治根腐病的相关机制,以期为西洋参根腐病相关的生物防治提供一定的理论依据。实验取得的结果如下:（1）以植物与农杆菌双元表达质粒（p CAMBIA1301）为母载体,在多克隆为点处引入来源于真菌RNAi基因沉默干扰质粒（p Silent-1）的Hyg表达框、Trcp启动子和终止子序列。构建了丝状真菌表达载体P-Trcp-HYG-Ds Red-GPDA,然后以含红色荧光蛋白基因的质粒p CMV-C-Ds Red为模板,克隆获得红色荧光蛋白基因序列,插入载体多克隆位点作为报告基因;同时在红色荧光蛋白N端引入真菌gpd A启... 

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 木霉菌在生防方面的研究进展
        1.1.1 木霉菌拮抗机制
        1.1.2 木霉菌促生作用
        1.1.3 木霉菌对作物的生防研究进展
    1.2 农杆菌介导的丝状真菌荧光蛋白遗传转化研究
        1.2.1 农杆菌介导转化
        1.2.2 农杆菌介导(ATMT)的真菌转化的特点
        1.2.3 荧光蛋白标记在植物病理中的应用
    1.3 西洋参根腐病相关研究进展
        1.3.1 西洋参根腐病
        1.3.2 生物防治相关研究
    1.4 土壤微生物群落的研究进展
        1.4.1 研究土壤微生物的重要性
        1.4.2 高通量测序技术探究土壤微生物
    1.5 本实验的研究意义和技术路线
        1.5.1 研究意义
        1.5.2 技术路线
第2章 真菌荧光蛋白表达载体的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 所用引物及序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒的转化
        2.2.2 质粒的提取
        2.2.3 实验操作
        2.2.4 载体构建步骤
        2.2.5 构建载体转化与验证
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 重组质粒图谱
        2.3.2 PCR检测电泳结果
        2.3.3 酶切检测电泳结果
        2.3.4 测序结果
    2.4 本章小结
第3章 农杆菌介导深绿木霉转化体系的构建与优化
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株及质粒
        3.1.2 培养基
        3.1.3 试剂及器材
    3.2 实验方法
        3.2.1 农杆菌的转化
        3.2.2 确定抑制农杆菌生长所需的头孢霉素浓度
        3.2.3 确定筛选木霉转化子所需的潮霉素B浓度
        3.2.4 农杆菌介导转化深绿木霉
        3.2.5 木霉基因组的提取与纯化
        3.2.6 木霉转化子的验证
        3.2.7 假定转化子的遗传稳定性分析
        3.2.8 深绿木霉转化条件的优化
    3.3 实验结果
        3.3.1 农杆菌转化PCR验证
        3.3.2 筛选转化子所需潮霉素的B浓度
        3.3.3 抑制农杆菌生长所需的头孢霉素浓度
        3.3.4 假转化子检测
        3.3.5 转化子的遗传稳定性分析
        3.3.6 转化条件的优化
        3.3.7 不同农杆菌对ATMT介导转化深绿木霉的转化效率的影响
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第4章 高通量测序分析深绿木霉对西洋参根腐病的生防作用
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 试剂与耗材
    4.2 实验方法
        4.2.1 实验设计
        4.2.2 现场准备
        4.2.3 样品的收集
        4.2.4 样品的处理与调查
        4.2.5 土壤样品基因组的提取
        4.2.6 测序分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 接种深绿木霉对西洋参出苗率的影响
        4.3.2 接种深绿木霉对西洋参发病率的影响
        4.3.3 OUT聚类分析
        4.3.4 Alpha多样性分析
        4.3.5 Bate多样性分析
        4.3.6 菌群差异分析
        4.3.7 土壤微生物的功能预测与分析
        4.3.8 微生物之间的互作关系分析
    4.4 本章小结
第5章 全文总结
    5.1 总结
    5.2 有待进一步研究的问题
参考文献
致谢
在学期间主要科研成果
    一、发表学术论文
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]木霉菌促生与拮抗作用研究进展[J]. 胡琼,刘茂泉.  农药. 2019(07)
[2]棘孢木霉活性代谢产物的初步分离及其抑菌与促生长功能[J]. 刘畅,吴长景,窦恺,刘志华,何正权,张福丽,庞丽,宋昊跃,葛红莲.  天津农业科学. 2019(07)
[3]哈茨木霉T2-16的GFP标记及其生防特性[J]. 田程,张屹,肖姬玲,朱菲莹,唐炎英,魏林,梁志怀.  中国生物防治学报. 2019(02)
[4]基于高通量测序的西洋参根际土壤细菌群落分析[J]. 李丽,蒋景龙.  中药材. 2019(01)
[5]西洋参根腐病发生与根际土壤细菌群落结构变化关系研究[J]. 蒋景龙,余妙,李丽,焦成瑾,徐皓,任绪明,杨玲娟.  中草药. 2018(18)
[6]木霉融合子Tpf-2的定殖及其对番茄防御酶系的影响[J]. 李纪顺,陈凯,李玲,赵忠娟,杨玉忠,杨合同.  植物保护. 2018(04)
[7]压砂西瓜枯萎病生防木霉菌筛选及其拮抗机制研究[J]. 张丽荣,李鹏,康萍芝,杜玉宁,陈杭.  河南农业科学. 2018(05)
[8]不同木霉菌株对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用[J]. 谷祖敏,毕卉,张兵,田晓颖.  西北农业学报. 2018(03)
[9]木霉菌在农业中的应用研究进展[J]. 袁扬,王胤晨,韩玉竹,张锦华,曾兵.  江苏农业科学. 2018(03)
[10]西洋参根腐病发生与根际真菌群落变化关系研究[J]. 余妙,蒋景龙,任绪明,李丽,焦成瑾,杨玲娟,徐皓.  中国中药杂志. 2018(10)

博士论文
[1]农杆菌介导哈茨木霉转化系统优化及突变体分析[D]. 黄亚丽.中国农业科学院 2008
[2]哈茨木霉（Trichoderma harzianum）发酵液中对豇豆具促生活性物质的研究[D]. 魏林.湖南农业大学 2005

硕士论文
[1]小麦根腐病菌的荧光标记及其与小麦的互作研究[D]. 闫立敏.河北科技师范学院 2012
[2]绿色木霉代谢抗生物质发酵条件优化、特性及其对芒果炭疽菌抑制作用研究[D]. 蒋雨.四川农业大学 2011



本文编号：3679027