棉铃虫羧酸酯酶基因克隆及原核表达

发布时间：2024-11-30 15:37

　　棉铃虫(Helicoverpa armigera)属鳞翅目夜蛾科昆虫,寄主范围非常广,是一种危害严重的世界性农业害虫。棉铃虫的防治主要以化学防治为主,长期的依赖化学农药,不可避免的对农药产生抗性。用药成本增加,治理难度加大。羧酸酯酶(CarE)属于昆虫体内一种重要的解毒酶系,它的存在与抗药性的产生机制有关。本研究从棉铃虫中肠提取RNA,克隆羧酸酯酶基因全长序列。并将获得的WH001d目的基因去除信号肽,经双酶切后与表达载体pET-32a(+)连接,转化到E.coli BL21(DE3)菌株中。重组载体用IPTG低温诱导表达,经SDS-PAGE检测,证明WH001d成功得到表达。进一步通过用Ni2+NTA亲和层析柱纯化,获得较纯的WH001d酶蛋白。优化表达条件,获得可溶性酯酶的表达水平,为后期通过酯酶体外定向进化提高其对有机磷杀虫剂的解毒活性及构建解毒酶工程菌奠定前期基础。主要结果如下：1.经TA克隆,获得棉铃虫WH001a, WH001d, WH001h, WHOOlg完整编码序列,长度分别为1665 bp,1662 bp,1665 bp,2241 bp。通过基因克隆得到WH001b,...

【文章页数】：42 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 前言
    1.2 棉铃虫分部与危害
    1.3 羧酸酯酶概况
        1.3.1 羧酸酯酶分类与命名
        1.3.2 羧酸酯酶结构功能机水解机制
    1.4 抗药性机理
        1.4.1 代谢抗性的分子基础
        1.4.2 羧酸酯酶的抗药性机制
    1.5 棉铃虫羧酸酯酶与抗性的研究进展
    1.6 研究目的和意义
    1.7 技术路线
第二章 材料与方法
    2.1 供试材料
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 菌种
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 溶液配制及培养基
        2.1.5 SDS-PAGE电泳试剂
        2.1.6 Ni-NTA亲和层析缓冲液配制
        2.1.7 测定蛋白浓度试剂
    2.2 试验方法
        2.2.1 羧酸酯酶基因克隆
        2.2.2 构建重组表达载体
        2.2.3 原核表达
        2.2.4 Ni²+亲和柱层析
        2.2.5 SDS-PAGE检测
        2.2.6 Bradford法测定蛋白浓度
第三章 结果与分析
    3.1 棉铃虫羧酸脂酶基因克隆和序列比对特征分析
    3.2 重组表达载体的构建
    3.3 诱导蛋白表达,纯化和检测
        3.3.1 纯化蛋白SDS-PAGE检测
        3.3.2 蛋白纯化后的浓度测定
第四章 问题与讨论
第五章 总结
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：4013028