Cyt C在斜纹夜蛾SL-1细胞凋亡中的功能研究

发布时间：2025-04-18 02:14

　　细胞凋亡(apoptosis)是指在多细胞生物体中由多种因子介导的细胞主动死亡的过程。自从上世纪90年代初开始,在哺乳动物、线虫和果蝇中细胞凋亡的研究已经非常广泛并且深入,其凋亡的分子机制也取得了很大进展。目前关于细胞凋亡的途径主要有两种,其中线粒体凋亡通路是其主要的途径。虽然细胞凋亡的分子机制在进化过程之中高度保守,但研究发现在线粒体介导的内源性凋亡途径中,哺乳动物是通过线粒体释放细胞色素C到胞质中引起细胞凋亡,而在果蝇和线虫的细胞凋亡中却与此不同。但是在鳞翅目昆虫细胞凋亡的研究中却发现细胞色素C的作用与哺乳动物相似,凋亡过程有细胞色素C释放事件。鉴于迄今为止关于鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中细胞色素C释放的检测、定位或者无细胞体系研究均是以哺乳动物细胞色素C和抗体进行的,为了阐明细胞色素C在鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中的作用及分子机制,我们将斜纹夜蛾细胞色素C的原核表达重组质粒(pET-28a-Cyt C)进行蛋白诱导表达纯化,将纯化出的内源性Cyt C蛋白用于斜纹夜蛾无细胞凋亡体系的研究；同时构建斜纹夜蛾Cyt C的真核表达载体,将其转染SL-1细胞,最终运用形态学观察,荧光定量法及细胞流式...

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 细胞凋亡概述
        1.1.1 细胞凋亡概念
        1.1.2 细胞凋亡的特征描述
        1.1.3 细胞凋亡与细胞坏死的区别
    1.2 细胞凋亡的途径
        1.2.1 外源性细胞的凋亡通路
        1.2.2 内源性的细胞凋亡通路
    1.3 细胞色素C在细胞凋亡中的作用
        1.3.1 细胞色素C的释放在凋亡级联反应中必不可少
        1.3.2 细胞色素C磷酸化作用可以调控细胞色素C的释放以及凋亡体的形成
        1.3.3 细胞色素C经过心磷脂氧化作用有助于自身的释放
    1.4 无细胞体系(cell-free system)与细胞凋亡
        1.4.1 无细胞体系
        1.4.2 无细胞体系与细胞凋亡的关系
        1.4.3 无细胞体系的分类及制备方法
    1.5 半胱氨酸蛋白酶(caspase)与细胞凋亡
        1.5.1 半胱氨酸蛋白酶概述
        1.5.2 Caspase与细胞凋亡
    1.6 研究背景和意义
2. 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 昆虫细胞
        2.1.2 菌种和载体
        2.1.3 主要试剂与试剂盒
        2.1.4 实验试剂的配制
        2.1.5 实验主要仪器设备
    2.2 实验方法与操作步骤
        2.2.1 昆虫细胞的复苏与培养
        2.2.2 SL-1 CytC蛋白的纯化(以活化50mL为例)
        2.2.3 蛋白免疫印迹检测纯化蛋白
        2.2.4 SL-1 CytC多克隆抗体的制备
        2.2.5 SL-1细胞无细胞体系的制备
        2.2.6 SL-1细胞核的提取制备
        2.2.7 SL-1内源性细胞色素C激活无细胞体系阈值确定
        2.2.8 形态学观察细胞核凋亡情况
        2.2.9 用荧光定量分析法检测SL-1细胞核凋亡后caspase-3的活性
        2.2.10 真核表达载体的构建与转染
        2.2.11 目的基因SL-1 Cytc与pIE1-EGFP-N1和pIE1-EGFP-C1连接
        2.2.12 Mito-Tracker Red CMXRos标记线粒体
        2.2.13 细胞流式技术检测细胞凋亡率
3. 实验结果
    3.1 SL-1 Cytc蛋白的纯化
    3.2 SL-1 Cytc多克隆抗体的制备及检测
    3.3 斜纹夜蛾内源性细胞色素C在无细胞体系中对细胞凋亡的影响
        3.3.1 SL-1细胞核于无细胞凋亡体系中凋亡形态学观察
        3.3.2 荧光分光光度计法检测内源性Cyt C在无细胞凋亡体系中对caspase-3的活性的变化
    3.4 构建Cyt C真核表达载体,将其转染到S1-1细胞中研究其功能
    3.5 真核表达载体转染SL-1细胞后,运用荧光定量法和细胞流式技术检测细胞色素C对细胞凋亡的作用
4. 讨论
参考文献
致谢



本文编号：4040362