Ha-SRP2基因在棉铃虫先天性免疫中的功能研究

发布时间：2017-06-06 16:12

  本文关键词：Ha-SRP2基因在棉铃虫先天性免疫中的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：SRP基因最早在美国白蛾(Hyphantria cunea)中被发现和命名(以前被命名为Hdd23),是一种免疫刺激后表达量上调的基因。后来在斜纹夜蛾(Spodoptera litura)中也鉴定到一个Hdd23基因的同源基因,研究发现各种压力因子(如被寄生蜂寄生、腹部切割、腹部结扎、低温,热胁迫等)能上调该基因的表达,因此该基因被命名为压力应激肽(stress-responsive peptide,SRP).本研究组前期在棉铃虫(Helicoverpa armigera)血细胞转录组中也鉴定到一个SRP基因(命名为Ha-SRP),研究显示Ha-SRP基因可能通过调控酚氧化酶原激活和结节反应这两种免疫反应而在棉铃虫先天免疫中起着重要的作用。最近我们从棉铃虫血细胞转录组中又鉴定到一个SRP基因,将其命名为Ha-SRP2(本文中将以前鉴定到的Ha-SRP基因重命名为Ha-SRP1).在本项研究中,我们利用蛋白原核表达、蛋白体外功能分析和RNA干扰几种方法较为系统的对Ha-SRP2基因在棉铃虫先天性免疫中的功能进行了研究。实验结果如下：1.Ha-SRP2基因的克隆和序列分析：克隆获得了Ha-SRP2基因的全长序列,该基因具有一个360bp的开放阅读框,编码一个具有119个氨基酸残基的蛋白质分子量为12.799kDa,等电点为6.04。该蛋白含有信号肽序列,无跨膜区序列,表明该蛋白是一种分泌型蛋白。氨基酸序列多重比对表明棉铃虫Ha-SRP2与其他鳞翅目昆虫SRP具有较高的相似性。2、组织特异性表达分析：利用半定量RT-PCR及荧光定量PCR的方法分析了Ha-SRP2基因在棉铃虫血细胞、脂肪体、中肠、表皮和马氏管这五种组织中的表达情况。研究结果显示：该基因在这五种组织中均有表达,其中在血细胞和马氏管中的表达量较高。3、免疫刺激对棉铃虫Ha-SRP2基因表达量的影响：利用荧光定量PCR的方法分析了免疫刺激后棉铃虫脂肪体和血细胞这两种主要免疫组织中Ha-SRP2基因表达量的变化。结果显示棉铃虫脂肪体和血细胞中Ha-SRP2基因在受到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌免疫刺激后表达量均有上调,表明Ha-SRP2基因可能与棉铃虫的先天性免疫有关。4.Ha-SRP2重组蛋白的原核表达及纯化：克隆Ha-SRP2成熟肽的cDNA序列,与pET-32a原核表达载体相连接,构建表达载体pET-32a-Ha-SRP2.将重组质粒导入大肠杆菌中并诱导蛋白表达,然后利用镍柱进行纯化,得到了纯度较高的Ha-SRP2重组蛋白。5.rHa-SRP2的功能分析：(1)rHa-SRP2在体外可以识别并结合大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；(2)rHa-SRP2在体外可以促进棉铃虫血浆中酚氧化酶原的激活；(3)rHa-SRP2体内可以促进棉铃虫的结节反应；(4) rHa-SRP2可以结合到棉铃虫血细胞的表面。6、RNA干扰实验：通过注射dsHa-SRP2将棉铃虫血细胞和脂肪体中Ha-SRP2基因的表达敲降后,棉铃虫血淋巴中酚氧化酶活性显著降低,棉铃虫结节反应的能力也受到抑制,进而导致棉铃虫血淋巴对侵入到血腔中的细菌的清楚能力显著下降。综上所述,上述实验结果表明Ha-SRP2基因可能通过介导酚氧化酶原激活反应和结节作用而在棉铃虫的先天性免疫反应中发挥着重要的作用。
【关键词】：结节作用 酚氧化酶原激活 先天性免疫 棉铃虫
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 1. 引言12-18
• 1.1 昆虫先天性免疫12-14
• 1.1.1 昆虫先天性免疫简介12
• 1.1.2 细胞免疫12-13
• 1.1.3 体液免疫13-14
• 1.2 酚氧化酶激活系统与结节作用14-16
• 1.3 SRP基因在昆虫先天性免疫中的研究16-17
• 1.4 本研究的意义17-18
• 2. 材料与方法18-37
• 2.1 实验材料18-20
• 2.1.1 实验棉铃虫18
• 2.1.2 实验载体和菌种18
• 2.1.3 实验仪器18-19
• 2.1.4 实验试剂和药品19-20
• 2.1.5 试剂配方20
• 2.2 实验方法20-37
• 2.2.1 棉铃虫Ha-SRP2基因的克隆及序列分析20-25
• 2.2.2 Ha-SRP2基因的组织特异性表达分析25-27
• 2.2.3 免疫刺激后Ha-SRP2基因表达量的变化27-28
• 2.2.4 Ha-SRP2基因的原核表达及蛋白纯化28-31
• 2.2.5 rHa-SRP2的功能实验31-33
• 2.2.6 RNA干扰实验33-37
• 3. 结果与分析37-47
• 3.1 棉铃虫Ha-SRP2基因的克隆及序列分析37-38
• 3.1.1 Ha-SRP2基因的克隆37
• 3.1.2 Ha-SRP2基因的序列分析37-38
• 3.2 Ha-SRP2基因的组织特异表达分析38-39
• 3.3 免疫刺激后棉铃虫Ha-SRP2基因表达量的变化39-40
• 3.4 Ha-SRP2重组蛋白的原核表达及蛋白纯化40-41
• 3.4.1 pET32a-Ha-SRP2重组质粒的构建40-41
• 3.4.2 rHa-SRP2及对照蛋白rTrx的诱导和纯化41
• 3.5 rHa-SRP2的功能实验41-44
• 3.5.1 菌结合实验41-42
• 3.5.2 结节实验42-43
• 3.5.3 rHa-SRP2与血细胞的结合实验43
• 3.5.4 酚氧化酶原激活实验43-44
• 3.6 RNA干扰实验44-47
• 3.6.1 RNA干扰后的荧光定量分析44-45
• 3.6.2 RNA干扰后酚氧化酶活性实验45
• 3.6.3 RNA干扰对棉铃虫结节的影响45-46
• 3.6.4 RNA干扰对棉铃虫血淋巴清除细菌能力的影响46-47
• 4. 讨论47-50
• 参考文献50-56
• 论文发表情况56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 王忠燕;高欢欢;翟一凡;于毅;;双翅目昆虫抗菌肽研究进展[J];山东农业科学;2015年09期

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3 王顺心,王台,朱宏,孙国荣;RNAi机制的研究进展[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;2004年03期

4 杨松;昆虫黑化反应的分子机制研究进展[J];国外医学(寄生虫病分册);2003年04期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 杨代群;棉铃虫中肽聚糖识别蛋白PGRP-C的基因克隆及表达模式[D];华中师范大学;2012年

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本文编号：426855