一株抗黄萎病的番茄内生放线菌的分离、筛选和鉴定

发布时间：2017-06-10 23:00

  本文关键词：一株抗黄萎病的番茄内生放线菌的分离、筛选和鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着番茄栽培面积不断扩大,越来越多不合理的栽培方式出现在生产实践中,加上倒茬困难,连年种植,设施蔬菜常发生植株生育迟缓、生长势下降、品质变劣、土传病原菌大量积累、真菌性病害大量发生等现象。黄萎病是设施番茄中最主要的病症之一,已成为限制番茄生产和商品化的瓶颈问题。放线菌一类具有分枝的丝状细胞和菌丝的一类细菌,广泛存在于不同的自然生态环境中。其多样性丰富,经发酵培养得到次级代谢产物具有诸多优良功效。许多放线菌对植物真菌性病害都有高效防治作用。同时,许多放线菌还表现出了一定的促生作用。作为目前相对较新的方向,植物内生放线菌以其得天独厚的天然优势,越来越受到生物防治及相关领域的关注,并且很多高效活性放线菌株已经作为优势菌源进行商品化加工成为生防菌剂和生物有机肥等。为了发掘具有高效生防作用的植物内生放线菌资源,本研究选用5种高效分离培养基分别对已充分研磨的健康和发病番茄植株的根内和根际土壤中的放线菌分离和纯化培养。将获得的菌株通过培养特征和菌落形态学特征初步去除重复,然后通过体外平板抑制试验分别对放线菌的孢子悬浮液和发酵液进行抑制真菌活性筛选。配合田间进行的番茄苗期试验,进一步验证放线菌的抗病和促生作用,及其在根内和根际的定殖能力。将筛选后得到的高效拮抗菌株进行16S rRNA基因序列扩增并测序。结合形态培养学特征和生理生化特性研究,对活性菌株进行多相分类鉴定,最终获得并确定目的放线菌株。为今后开发和利用植物内生放线菌资源的抗病性筛选提供数据支持和实践基础,为内生放线菌分离源的针对性选择提供参考依据,同时对未来生产实践中生防菌剂的制备和使用积累生防菌资源。本研究主要结果如下:(1)以发病番茄植株和紧邻的健康作为分离源,共分离得到的86株不同放线菌。其中50株来自健康植株,36株来自发病植株。根内共分离纯化得到32株放线菌,根际土壤中得到54株。(2)对分离纯化出的86株植物内生放线菌进行体外抑菌活性检测。其中8株对黄萎病菌表现出明显抑制作用。在这8株拮抗菌中,3株来自健康植株(HHV1-5、HGS2-9、HAAG3-8);5株来自发病植株(DDPA1-2、DHV3-2、DAAG1-10、DGS3-6、DGS2-8)。其中DHV3-2对番茄黄萎病菌表现出了最大抑制活性,抑制半径显示为18.2mm。其抑制活性显著高于其他放线菌。此外,DHV3-2还对很多病原真菌都显示出了抑制作用。(3)对放线菌DHV3-2进行了多相分类学鉴定。通过分子生物学鉴定、形态培养特征鉴定以及生理生化特性鉴定,最终确定该菌株属于链霉菌属。(4)通过番茄苗期试验验证,接种高浓度内生放线菌DHV3-2对番茄黄萎病具有明显的抑制作用,发病率和病情指数均显著降低;且具有一定的促生长效果,接种放线菌可以显著提高番茄幼苗的株高、地上部鲜质量和全株鲜质量;且在番茄幼苗的根组织和根际土壤中均有一定的定殖能力。综上所述,本实验中,相较于根组织,在番茄根际土壤中可培养放线菌的种类更为丰富。相较于番茄健康株,在番茄发病株中发现了更多不同的活性放线菌。通过体外抑菌试验筛选出最高活性的菌株DHV3-2,并在苗期活体试验中,表现出了较强的抗病作用和一定的促生作用。且DHV3-2具有一定的定殖能力。经鉴定,DHV3-2是一株具有较大潜力的链霉菌。
【关键词】：番茄 内生放线菌 生物防治 黄萎病 链霉菌
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-18
• 1.1 研究目的与意义12
• 1.2 国内外研究的动态和趋势12-16
• 1.2.1 番茄产业现状及黄萎病防治措施12-13
• 1.2.2 植物内生放线菌的定义13
• 1.2.3 植物内生放线菌的生态重要性13-14
• 1.2.4 植物内生放线菌的多样性14-15
• 1.2.5 内生菌防治植物病害研究进展15-16
• 1.3 本研究的主要内容及技术路线16-18
• 1.3.1 本研究主要内容16-17
• 1.3.2 本研究技术路线17-18
• 2 材料与方法18-31
• 2.1 试验材料18
• 2.1.1 植株和根际土壤样品18
• 2.1.2 供试真菌18
• 2.1.3 供试品种18
• 2.2 试剂与仪器18-19
• 2.2.1 主要试剂18-19
• 2.2.2 主要仪器19
• 2.3 主要培养基及制备方法19-22
• 2.3.1 分离培养基19-20
• 2.3.2 纯化培养基20
• 2.3.3 菌丝体培养基20
• 2.3.4 大肠杆菌培养基20
• 2.3.5 生测培养基20
• 2.3.6 生理生化测定培养基20-21
• 2.3.7 形态观察培养基21
• 2.3.8 发酵培养基21-22
• 2.4 根组织和根际土壤中放线菌分离22-23
• 2.4.1 样品根组织中放线菌的分离纯化22
• 2.4.2 根际土壤中放线菌的分离纯化22-23
• 2.5 放线菌体外抑制活性检测23-24
• 2.5.1 放线菌对黄萎病菌活性初测23
• 2.5.2 放线菌对黄萎病菌活性验证23
• 2.5.3 放线菌发酵液抑菌活性检验23-24
• 2.6 放线菌多相分类鉴定24-28
• 2.6.1 形态和培养特征鉴定24
• 2.6.2 生理生化特征鉴定24-26
• 2.6.3 分子水平鉴定26-28
• 2.7 苗期试验放线菌的生防和促生效果28-30
• 2.7.1 番茄黄萎病菌的致病能力验证28-29
• 2.7.2 苗期试验验证抗番茄黄萎病防效29
• 2.7.3 放线菌对番茄幼苗的促生作用29
• 2.7.4 放线菌在番茄幼苗根部定殖能力29-30
• 2.8 数据分析30-31
• 3 结果与分析31-43
• 3.1 番茄内生放线菌分离及纯化31-32
• 3.2 放线菌体外抑菌活性检验32-36
• 3.2.1 放线菌孢子的抑制活性32-35
• 3.2.2 放线菌发酵液的抑制活性35-36
• 3.3 放线菌多相分类鉴定36-39
• 3.3.1 16S r RNA序列测定及系统进化分析36-37
• 3.3.2 形态及培养特征37-38
• 3.3.3 生理生化特征38-39
• 3.4 苗期试验放线菌的生防和促生效果39-43
• 3.4.1 番茄黄萎病菌的致病能力测定39-40
• 3.4.2 苗期试验验证抗番茄黄萎病防效40-42
• 3.4.3 放线菌对番茄幼苗的促生作用42
• 3.4.4 放线菌在番茄幼苗根部定殖能力42-43
• 4 讨论43-45
• 4.1 植株发病后对活性菌株的招募能力43
• 4.2 活性菌株的抗病促生作用与定殖能力的关系43-44
• 4.3 放线菌株的鉴定和比对情况44-45
• 5 结论45-46
• 致谢46-47
• 参考文献47-54
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文54

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本文编号：440155