苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆及特性研究

发布时间：2017-06-22 09:07

  本文关键词：苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆及特性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蛋白酶(Protease)主要参与蛋白质的合成与降解,是所有生物体维持自身生长发育必不可少的一种酶。丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是蛋白酶的重要成员,是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶。研究表明,昆虫丝氨酸蛋白酶参与昆虫消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。由于在昆虫消化和先天免疫中所起的重要作用,昆虫丝氨酸蛋白酶已经成为国内外实验室的研究热点,但当前对昆虫丝氨酸蛋白酶的研究主要以黑腹果蝇Drosophila melanogaster和家蚕Bombyx mori等模式昆虫居多,而对重要的农业害虫研究相对较少。苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca是大豆上重要的食叶害虫,有时会引发局部严重危害,已成为主要的大豆害虫之一。本试验以苜蓿夜蛾H.viriplaca为研究对象,克隆得到苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因,并命名为HvSP,该基因已登录GenBank,登录号为KT907053。用大肠杆菌E.coli表达系统对其进行表达,再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。同时对HvSP基因的m RNA在苜蓿夜蛾多个组织中的特异性表达进行了研究,最后通过体外注射双链RNA对HvSP基因的RNA干扰效果进行检测。本文主要研究结果如下:(1)HvSP基因长1017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,含有34 bp和95 bp的5'和3'非编码区,N端含有17个氨基酸组成的信号肽。由HvSP基因推导的蛋白质分子量为30.8 kDa,等电点为8.27。NCBI Blast搜索发现HvSP推导出的氨基酸序列与鳞翅目昆虫丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源性达到46%~92%,其中同源性较高的均为胰凝乳蛋白酶,推断本试验获得的丝氨酸蛋白酶为胰凝乳蛋白酶。(2)将本试验得到的HvSP基因与原核表达载体pET21b连接,并将重组质粒转入BL21感受态细胞里,用大肠杆菌E.coli表达系统进行原核表达,目的菌株经IPTG诱导后进行SDS-PAGE,结果显示,含目的基因的HvSP重组质粒在相对分子质量接近30.8 kDa处,有一条明显的目的条带,与预测的蛋白分子量相近,而未插入目的基因的p ET21b空载体未检测到目的条带,说明成功表达外源蛋白。再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。酶活性测定结果表明在0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性达到最高,为28.7 U/m L。(3)荧光定量PCR结果表明,前肠、中肠、后肠、马氏管、脂肪体都发现了HvSP基因的mRNA表达,但在唾腺中并没有发现。和其他组织相比,HvSP基因在中肠中的表达量最高,是脂肪体表达量的14倍,并且与其他组织差异显著(p0.05),这表明HvSP基因主要存在于苜蓿夜蛾的中肠组织中。(4)HvSP基因的RNA干扰结果表明,72 h后,注射了2μL含2μg/μL的dsHvSP的苜蓿夜蛾幼虫相比对照组,基因表达量下降了65%,本试验说明,通过RNA干扰技术成功沉默HvSP基因。
【关键词】：苜蓿夜蛾 丝氨酸蛋白酶 克隆 原核表达 RNA干扰
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.4
【目录】：

• 摘要10-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-18
• 1.1 苜蓿夜蛾13
• 1.2 鳞翅目昆虫消化酶13
• 1.3 昆虫丝氨酸蛋白酶的研究进展13-14
• 1.4 昆虫丝氨酸蛋白酶的分类与结构14-16
• 1.4.1 昆虫胰蛋白酶14-15
• 1.4.2 昆虫胰凝乳蛋白酶15-16
• 1.5 昆虫丝氨酸蛋白酶抑制剂16-17
• 1.6 本研究的目的与意义17-18
• 2 材料与方法18-38
• 2.1 试验材料18-20
• 2.1.1 供试昆虫18
• 2.1.2 菌株与质粒18
• 2.1.3 主要分子生物学试剂18
• 2.1.4 所需溶液的配制18-19
• 2.1.5 主要仪器设备19-20
• 2.2 苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因的克隆20-29
• 2.2.1 RNA提取20
• 2.2.2 cDNA第一链的合成20-21
• 2.2.3 丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列片段克隆21-24
• 2.2.4 利用RACE克隆基因的3'cDNA序列和5'cDNA序列24-29
• 2.2.5 丝氨酸蛋白酶全长cDNA序列的获得29
• 2.3 序列分析29-30
• 2.3.1 序列相似性分析29
• 2.3.2 核苷酸序列分析29
• 2.3.3 蛋白质基本性质与结构分析29-30
• 2.3.4 多重比对与系统进化分析30
• 2.4 丝氨酸蛋白酶基因的原核表达及活性测定30-34
• 2.4.1 丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的PCR扩增30-31
• 2.4.2 酶切反应31
• 2.4.3 大肠杆菌表达载体的构建31-32
• 2.4.4 丝氨酸蛋白酶基因的诱导表达和SDS-PAGE32-33
• 2.4.5 重组蛋白变性、纯化与复性33-34
• 2.4.6 重组蛋白的活性测定34
• 2.5 丝氨酸蛋白酶基因在苜蓿夜蛾不同组织中的特异性表达34-36
• 2.5.1 丝氨酸蛋白酶基因在不同组织的表达34-35
• 2.5.2 荧光定量PCR引物设计35
• 2.5.3 荧光定量PCR的反应体系和步骤35
• 2.5.4 荧光定量PCR的数据处理35-36
• 2.6 丝氨酸蛋白酶基因的RNAi研究36-38
• 2.6.1 设计引物RNAi引物36
• 2.6.2 体外合成dsRNA36-37
• 2.6.3 dsRNA的纯化37
• 2.6.4 dsRNA的注射37
• 2.6.5 RNA干扰效果的检测37-38
• 3 结果与分析38-54
• 3.1 Hv SP基因cDNA的克隆38-39
• 3.1.1 苜蓿夜蛾总RNA的提取38
• 3.1.2 HvSPcDNA的克隆38-39
• 3.2 HvSP基因cDNA序列分析及系统发育分析39-43
• 3.2.1 HvSP基因cDNA的序列分析39-40
• 3.2.2 HvSP基因同源性比较和系统进化树分析40-43
• 3.3 HvSP基因推导的氨基酸特征分析43-46
• 3.3.1 苜蓿夜蛾总RNA的提取43
• 3.3.2 信号肽分析43-44
• 3.3.3 氨基酸疏水性分析44-45
• 3.3.4 N-糖基化位点分析45
• 3.3.5 蛋白三维模型构建45-46
• 3.4 HvSP基因的原核表达及活性测定46-49
• 3.4.1 HvSP基因重组表达载体的构建及鉴定46-47
• 3.4.2 重组蛋白HvSP-pET21b的诱导表达47-48
• 3.4.3 重组蛋白的纯化、复性和活性测定48-49
• 3.5 HvSP基因在不同组织的表达分析49-51
• 3.5.1 荧光定量PCR引物特异性检验49-51
• 3.5.2 HvSP在不同组织的表达分析51
• 3.6 RNAi结果分析51-54
• 3.6.1 dsRNA的合成51-52
• 3.6.2 RNAi处理后HvSP基因表达量的变化52-54
• 4 讨论54-58
• 4.1 HvSP基因的克隆及序列分析54
• 4.2 HvSP基因的原核表达及活性分析54-55
• 4.3 HvSP基因在不同组织表达研究55-56
• 4.4 HvSP基因的RNAi研究56-58
• 5 结论58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-67
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文67

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