我国常见粉蚧类害虫双基因条形码鉴定技术研究

发布时间：2017-08-02 09:07

  本文关键词：我国常见粉蚧类害虫双基因条形码鉴定技术研究

  更多相关文章： 粉蚧科 双基因DNA条形码 mtDNA COI 28S rRNA 种特异性SS-COI引物 分子鉴定

【摘要】：粉蚧属半翅目Hemiptera、粉蚧科Pseudococcidae,是一类重要的世界性检疫性害虫。粉蚧类害虫种类繁多,已知种类2000余种;且体形微小、形态多样、寄主范围广、隐蔽性强,极易随国际贸易活动传播扩散,给农林业生产带来了巨大威胁。通常,口岸截获的粉蚧多为若虫或残体,加之隐存种/复合种的存在和较小的近缘种间差异,严重影响了基于形态学特征的粉蚧类害虫识别鉴定的准确性和时效性。本研究以线粒体COI基因和核糖体28S rRNA为靶标,研究探讨了双基因DNA条形码在粉蚧鉴定中的作用,评价了该技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧的鉴定有效性;同时,针对重大检疫性害虫木薯绵粉蚧研发出了其种特异性检测鉴定技术体系。具体研究结果如下:(1)粉蚧类昆虫全基因组DNA提取方法的评价研究。以雌性成虫、卵、各龄期若虫等为对象,分析比较了8种DNA提取方法,明确了SDS法最适于粉蚧类害虫高龄若虫和雌成虫DNA提取,DeBarro法适于卵和低龄若虫DNA提取,有效解决了粉蚧类害虫体表蜡质较厚,DNA得率不高的难题。(2)双基因条形码技术在我国常见粉蚧鉴定中的应用。以来自国外11个种群、国内93个种群的9属22种粉蚧461个个体为对象,以COI基因5’端和28S基因D2-D3区段为靶标,通过碱基序列测定和分析,以及种内种间遗传距离计算,并同时整合数据库中高质量的相关种的靶标序列,分别构建系统发育树。结果显示,22种粉蚧的COI基因5’端序列具有48个单倍型,而28S基因D2-D3序列则具有33个单倍型。当以COI基因5’端序列为靶标时,22种粉蚧的种内遗传距离为0.0000~0.0160,平均为0.0034;种间遗传距离均大于2%,为0.0220~0.1780,平均为0.0921;种间遗传距离是种内遗传距离的27.1倍;且种内遗传距离与种间遗传距离之间不存在重叠区域。在基于COI-5’序列构建的系统发育树中,各物种均具有独立的进化分支。当以28S基因D2-D3区段为靶标时,部分属内十分保守,种内遗传距离与种间遗传距离之间存在重叠现象,不能对部分近缘种进行有效区分;而属间变异相对较大。同时,研究还显示,大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧可能存在隐存种或复合种;而粉蚧属可能存在多起源现象。进而表明,COI基因较28S基因更适合于种间的物种鉴定;而COI基因和28S基因的联合应用,有利于提高DNA条形码技术对粉蚧类害虫的鉴定能力,实现对粉蚧类害虫的准确识别与鉴定。(3)DNA条形码技术对近缘种粉蚧-重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧和土著种柑橘臀纹粉蚧的鉴定有效性研究。以旅检截获的36头大洋臀纹粉蚧为对象、其近缘种柑橘臀纹粉蚧为参照,序列分析表明,当分别以COI基因5’端和3’端序列为靶标时,截获大洋臀纹粉蚧的碱基序列与数据库中靶标种的序列相似性分别为100%和99~100%,而与近缘种柑橘臀纹粉蚧的相似性分别为97~98%和96~98%;且大洋臀纹粉蚧和柑橘臀纹粉蚧分别存在5个和12个稳定的物种特异性鉴别位点;系统发育分析显示,截获的大洋臀纹粉蚧均与数据库中的靶标种聚为一支。当以28S基因D2-D3区段序列为靶标时,臀纹粉蚧属各物种间高度保守,无法区分大洋臀纹粉蚧与其近缘种柑橘臀纹粉蚧;种间遗传距离仅为0.004。此外,进一步的物种识别软件评价结果显示,基于COI基因5’端和3’端序列的鉴定结果完全正确,而基于28S基因D2-D3区段序列的鉴定结果却存在45.2~61.9%的模糊鉴定。表明,基于COI基因5’端和3’端的DNA条形码技术完全可用于大洋臀纹粉蚧的准确鉴定及检测监测,对有效阻截其入侵和进一步扩散蔓延意义重大。(4)重大潜在入侵害虫木薯绵粉蚧的快速PCR检测技术研究。基于测序获得的COI基因5’端序列,设计木薯绵粉蚧的种特异性SS-COI引物1对(PMSSZW-1F/PMSSZW-1R),其扩增片段大小为353 bp;以我国口岸经常截获的扶桑绵粉蚧等8种粉蚧为参照,研究验证该引物对的种特异性,以及检测灵敏性和检测阈值。结果显示,该引物对只对木薯绵粉蚧具有扩增能力,对我国口岸经常截获的其他8种粉蚧不具扩增效果;同时,对不同虫态、龄期、成虫残体以及来自不同寄主植物的木薯绵粉蚧亦具良好的扩增效果,其最低检出阈值为135.22±10.41 pg/μL(相当于1/20480头雌性成虫)。木薯绵粉蚧的种特异性快速检测技术具有快速、可靠、准确、灵敏的特点,能大大提高口岸检验检疫效率,该技术体系的建立为木薯绵粉蚧的检测、监测与有效阻截提供了技术支撑,对保障我国木薯产业的健康发展具有重要意义。本研究围绕粉蚧科昆虫种类多、体形小、存在多型、多态,对农林业生产威胁巨大,却难以快速准确识别的问题,研究构建了较为完善的粉蚧科双基因DNA条形码鉴定技术体系。而重大潜在入侵物种木薯绵粉蚧种特异性快速检测技术的研发与建立,及其与双基因条形码技术等分子鉴定手段的联合应用,必将在检疫性粉蚧类害虫的检测监测和风险预警中发挥巨大作用,并为“一带一路”区域农业绿色生产与健康发展,以及国家粮食安全与生态安全提供强有力的技术支撑。
【关键词】：粉蚧科 双基因DNA条形码 mtDNA COI 28S rRNA 种特异性SS-COI引物 分子鉴定
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.39
【目录】：

• 摘要7-9
• abstract9-16
• 第一章 引言16-27
• 1.1 DNA条形码技术概况16-17
• 1.2 DNA条形码技术在重大农林入侵害虫研究中的应用17-25
• 1.2.1 在介壳虫类昆虫研究中的应用17-19
• 1.2.2 在实蝇类害虫研究中的应用19-21
• 1.2.3 在粉虱类害虫研究中的应用21-22
• 1.2.4 在蓟马类昆虫研究中的应用22-24
• 1.2.5 在其他重大农林入侵害虫研究中的应用24-25
• 1.3 粉蚧类昆虫DNA条形码鉴定技术研究内容及研究方法25-27
• 1.3.1 研究内容25-26
• 1.3.2 技术路线26-27
• 第二章 粉蚧类昆虫全基因组DNA提取方法的评价研究27-35
• 2.1 材料与方法27-29
• 2.1.1 供试虫源27-28
• 2.1.2 全基因组DNA提取28
• 2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳检测28
• 2.1.4 DNA纯度检测和浓度测定28-29
• 2.1.5 PCR扩增和电泳检测29
• 2.1.6 SDS法DNA检测效果的测定29
• 2.2 结果与分析29-33
• 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测29-30
• 2.2.2 DNA纯度和得率30-31
• 2.2.3 PCR扩增效果31-32
• 2.2.4 SDS法的DNA检测效果32-33
• 2.3 讨论33-35
• 第三章 双基因条形码技术在我国常见粉蚧鉴定中的应用35-58
• 3.1 材料与方法36-43
• 3.1.1 供试虫源36
• 3.1.2 DNA提取36-42
• 3.1.3 PCR扩增、电泳检测以及序列测定42
• 3.1.4 COI基因和 28S基因序列分析42-43
• 3.2 结果与分析43-53
• 3.2.1 PCR扩增、序列测定及序列分析43-44
• 3.2.2 种内与种间遗传距离44-48
• 3.2.3 系统发育分析48-53
• 3.3 讨论53-58
• 第四章 DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧的鉴定有效性研究58-69
• 4.1 材料与方法59-61
• 4.1.1 供试虫源59-60
• 4.1.2 DNA提取60
• 4.1.3 PCR扩增、电泳检测及序列测定60
• 4.1.4 序列处理与分析60-61
• 4.2 结果与分析61-66
• 4.2.1 PCR扩增及序列分析61-62
• 4.2.2 序列单倍型和相似性分析62-63
• 4.2.3 系统发育分析63-65
• 4.2.4 物种鉴定的有效性评价65-66
• 4.2.5 物种鉴定的准确率评价66
• 4.3 讨论66-69
• 第五章 重大潜在入侵害虫木薯绵粉蚧种特异性检测技术研究69-78
• 5.1 材料与方法71-73
• 5.1.1 供试虫源71-72
• 5.1.2 DNA提取72
• 5.1.3 粉蚧类昆虫COI基因 5’端序列的扩增72
• 5.1.4 木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物的设计72-73
• 5.1.5 木薯绵粉蚧SS-COI引物的种特异性检验73
• 5.1.6 木薯绵粉蚧SS-COI引物的灵敏性的检测73
• 5.2 结果与分析73-76
• 5.2.1 粉蚧类昆虫COI基因 5’端序列的扩增及分析73-74
• 5.2.2 木薯绵粉蚧SS-COI引物的种特异性检验74-75
• 5.2.3 SS-COI引物对不同虫态、龄期、成虫残体以及不同寄主来源木薯绵粉蚧的扩增75
• 5.2.4 SS-COI 引物对木薯绵粉蚧的检测阈值75-76
• 5.3 讨论76-78
• 第六章 结论与展望78-80
• 6.1 结论78-79
• 6.1.1 粉蚧类昆虫全基因组DNA提取方法的比较78
• 6.1.2 双基因条形码技术在我国常见粉蚧鉴定中的应用78
• 6.1.3 DNA条形码技术对重大潜在入侵害虫大洋臀纹粉蚧的鉴定有效性78
• 6.1.4 重大检疫性害虫木薯绵粉蚧的种特异性检测技术78-79
• 6.2 创新点79
• 6.3 展望79-80
• 参考文献80-103
• 致谢103-104
• 作者简历104

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 褚栋;刘国霞;付海滨;徐卫;;线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(mtCOⅠ)序列分析揭示扶桑绵粉蚧复合种存在隐存谱系(英文)[J];昆虫学报;2009年11期

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本文编号：608493