利用核糖体工程技术提高荧光假单胞菌Pf-5菌株活性次级代谢产物产量

发布时间：2017-08-04 22:08

  本文关键词：利用核糖体工程技术提高荧光假单胞菌Pf-5菌株活性次级代谢产物产量

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【摘要】：荧光假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)是一种重要的植物根际共生菌,它能够产生多种具有抗菌作用的活性次级代谢产物,包括藤黄绿脓菌素(Plt)、2,4-二乙酰基藤黄酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、嗜铁素等。这些次级代谢产物能拮抗不同的病原菌,在农作物土传病害的生物防治研究中具有重要意义。野生型菌株中各类活性代谢产物的产量通常较低,在生物防治应用中效果有限。当前,通过核糖体工程技术(Ribosome engineering)等手段进行菌株改良提高次级代谢产物产量是一条十分有效的途径。为了提高Pf-5菌株中活性的次级代谢产物的产量,本研究利用核糖体工程技术在高浓度的利福平筛选下,分离得到利福平自发抗性突变株60株。通过比较原始株Pf-5和突变株的抑菌效果发现,其中7株突变菌株较原始菌的抗真菌能力增强。对这7株突变菌株的DNA序列进行测序分析,发现均在编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因出现点突变,保守区域rif-cluster I区间第1591位的胞嘧啶突变为腺嘌呤,相应的编码氨基酸残基由组氨酸突变为天冬酰胺。利用HPLC对次级代谢产物产量进行比较分析,结果表明相比于原始菌株,突变菌R55的2个主要抑菌活性代谢物(B和D)合成能力都有不同程度的提高:其中产物B提高了2.5倍左右,产物D提高了1.4倍左右。利用质谱等手段测定表明:产物B和D分别为:藤黄绿脓菌素、2,4-二乙酰藤黄酚。抑菌实验表明产物藤黄绿脓菌素、2,4-二乙酰藤黄酚对烟草黑胫病菌和枇杷炭疽病菌都显示了不同程度的抑制效果。此外,本研究还在Pf-5菌株中过表达了R55的ropBR基因,构建了工程菌株Pf-rpoBR。工程菌能在高浓度的利福平抗性板上生长,CAS平板实验发现工程菌的嗜铁素产量有较大幅度的提升。本研究以荧光假单胞菌Pf-5为出发菌株,引入利福平抗性突变位点,获得一株两种抗生素产量同时提高且抑菌活性大幅增强的突变株R55,并鉴定了其突变位点,经过反复传代验证,突变株的利福平抗性能稳定遗传。研究结果体现了核糖体工程技术在革兰氏阴性细菌选育上的重大潜在应用价值。
【关键词】：荧光假单胞Pf-5 核糖体工程 利福平 次级代谢产物
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 引言10-24
• 1 植物病害与生物防治10-12
• 1.1 植物病害生物防治的概念及作用机理10
• 1.2 生防细菌在生物防治中的应用10-12
• 2 荧光假单胞菌与生物防治12-19
• 2.1 荧光假单胞菌的主要类群12
• 2.2 荧光假单胞菌生物防治作用12-13
• 2.3 荧光假单胞菌生防机理13-15
• 2.4 荧光假单胞菌抗生性代谢产物在生防治中的应用15-17
• 2.5 荧光假单胞菌的育种改良17-19
• 3 核糖体工程概述19-22
• 3.1 核糖体工程的概念19
• 3.2 核糖体工程的作用机制19-21
• 3.3 核糖体工程的应用进展21-22
• 4 立题依据和研究目的22-24
• 第二章 材料与方法24-40
• 1 材料24-31
• 1.1 菌株与质粒24-25
• 1.2 培养基25-26
• 1.3 抗生素26
• 1.4 引物与测序26-27
• 1.5 工具酶与标准分子量27
• 1.6 常用试剂与试剂盒27-30
• 1.7 仪器与设备30-31
• 2 方法31-40
• 2.1 菌株的培养与保藏31
• 2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定31
• 2.3 抗性突变株的筛选31
• 2.4 抗性突变株的真菌抑制活力测定31-32
• 2.5 发酵产物的高效液相色谱分析32
• 2.6 抑菌活性产物的质谱鉴定32-33
• 2.7 突变株的抑菌活性测试33
• 2.8 菌体全蛋白的提取及分析33-34
• 2.9 突变株与原始菌株生理特性的比较34-35
• 2.10 细菌基因组DNA的提取35-36
• 2.11 突变位点的鉴定36-38
• 2.12 过表达载体的构建38
• 2.13 工程菌Pf5rpoB~R的构建38-40
• 第三章 结果与分析40-55
• 1 利福平对荧光假单胞菌Pf-5 菌株最低抑制浓度的确定40
• 2 利福平自发抗性突变株的筛选40-41
• 3 突变位点的鉴定41-42
• 4 代谢产物的色谱分析42-44
• 5 代谢产物的抑菌活性研究44-46
• 6 原始菌株与突变菌株在不同时期的代谢产物产量分析46-47
• 7 代谢产物的质谱分析47-48
• 8 突变株的表型特征比较48-50
• 9 重组质粒pUCP24-rpoB~R的构建50-51
• 10 工程菌株Pf-rpoB~R的构建51-52
• 11 工程菌株的活性产物产量分析52-53
• 12 突变菌蛋白表达水平的差异分析53-55
• 第四章 讨论55-58
• 参考文献58-66
• 缩略词表66-67
• 攻读硕士学位期间发表的论文67-68
• 本论文感谢以下基金项目的资助68-69
• 致谢69

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本文编号：621950