棉铃虫糖基转移酶家族基因的克隆及特征分析

发布时间：2017-08-10 01:21

  本文关键词：棉铃虫糖基转移酶家族基因的克隆及特征分析

  更多相关文章： 棉铃虫 糖基转移酶 Bt抗性 分子克隆 亚细胞定位

【摘要】：鞘糖脂(Glycosphingolipids,GSLs)在诸如细胞识别、细胞分化和细胞发育等方面发挥着重要作用,同时它还是很多细菌毒素的受体,例如霍乱弧菌、痢疾杆菌。糖基转移酶是GSLs合成的催化酶,相关糖基转移酶基因(bre)的变异已经在线虫中被证实与Bt抗性有关。在昆虫中,糖基转移酶具有很大的类群,相关功能及变异的发生具有很大的不确定性,它不仅是鞘糖脂合成的催化酶,同时可能在钙粘蛋白(Cadherin,CAD)、氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)、碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase,ALP)和糖蛋白的修饰过程中发挥作用,所以糖基化变异可能不仅仅针只对一种Bt毒素受体,可能会同时影响几种重要的结合受体。本研究综合运用分子生物学技术和生物信息学技术,首次克隆获得Harmbre2-4 ORF全长序列并初步研究了棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-5的功能,主要研究内容及结果如下:1、利用RT-PCR及RACE技术克隆获得了棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-4的ORF全长序列并提交GenBank。预测Harmbre2(GenBank KR362875)、Harmbre3(GenBank KR362876)和Harmbre4(GenBank KR362877)的ORF全长序列长度分别为1011bp、1377bp和1275bp;分别编码336、458和424个氨基酸;分子量分别为38、52和48kDa;等电点分别为8.75、8.62和8.90。氨基酸序列分析显示HarmBre2-4中只有HarmBre4有信号肽序列。HarmBre2没有跨膜区,而HarmBre3和HarmBre4分别有5个和1个跨膜区;每个氨基酸序列中都包含对该类糖基转移酶的催化起重要作用的保守序列。HarmBre3和家蚕(Bombyx mori)的Bre3(GenBank NP_001243979.1)的相似度高达86%,和小菜蛾(Plutella xylostella)的Bre3(GenBank ADB79796.1)的相似度达到83%。HarmBre2和HarmBre4也和鳞翅目其他害虫的该类基因氨基酸序列具有很高的相似度。2、运用qPCR分析了Harmbre2-5在棉铃虫体内的时空表达谱。结果显示在棉铃虫不同发育阶段中,Harmbre2、Harmbre3和Harmbre5在卵中表达量较高,Harmbre3和Harmbre4在成虫阶段表达量也较高,Harmbre2-5在棉铃虫幼虫阶段和蛹期的表达量相对较低,而且在不同的幼虫阶段和蛹期的表达量没有显著性差异。通过分析Harmbre2-5在棉铃虫4龄幼虫不同组织中的表达水平差异显示:这四个基因在棉铃虫肠中的表达量都较低,尤其是在中肠中。Harmbre2在马氏管中表达量较高;而在其他组织中表达量都比较低,且它们之间没有显著性差异。Harmbre3在头部和围食膜中表达量较高;Harmbre4在马氏管中表达量较高;Harmbre5也相类似,在围食膜和马氏管中表达量较高。3、通过细胞水平实验对Harmbre2、3和5的功能进行研究。结果显示Harmbre2、Harmbre3和Harmbre5表达的蛋白均定位在高尔基体、内质网等细胞质的细胞器内,而在细胞核内没有分布。4、通过RNAi技术干扰Harmbre2-5基因的表达,利用qPCR技术检测沉默效率。结果显示注射靶标基因的siRNA后,Harmbre2的基因表达水平下降30%左右,Harmbre3-5的基因表达水平下降50%左右。5、通过RT-PCR技术和实时荧光定量PCR技术分析Harmbre2-5在棉铃虫抗感品系间的基因结构和基因表达水平差异。结果显示Harmbre3-5在棉铃虫LF系列抗感品系间的基因结构和表达水平没有差异,Harmbre2在棉铃虫LF系列低抗品系里的表达量显著高于敏感品系,而且其基因结构的5′UTR区,抗性品系与敏感品系相比缺失几个碱基,5′UTR区有转录调控基因表达的功能,推测这种差异可能与棉铃虫Bt抗性有关。以上结果表明,棉铃虫bre基因在卵和成虫阶段高表达,在幼虫阶段和蛹期表达量较低,这表明Harmbre可能与棉铃虫的生育力和进化有关;同时在马氏管、围食膜和头部表达量较高,而在肠中尤其是中肠中表达量很低,表明Harmbre可能在棉铃虫的细胞生长发育、信号转导等功能方面发挥重要作用。细胞水平实验表明糖基转移酶主要分布在核膜、内质网等细胞质部位。抗感品系差异分析发现Harmbre2在低抗棉铃虫体内的表达量较高,且在抗性品系中,其基因的5′UTR区也存在几个碱基的变异,推测Harmbre2的表达上调或者基因突变可能引起棉铃虫对Cry1Ac的低水平抗性。本研究对棉铃虫糖基转移酶基因的功能做了初步研究,为下一步研究其明确功能及其与棉铃虫Bt抗性的关系奠定了基础,旨在进一步发掘棉铃虫Bt抗性的新机制。
【关键词】：棉铃虫 糖基转移酶 Bt抗性 分子克隆 亚细胞定位
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 引言15-21
• 1.1 鞘糖脂15-17
• 1.1.2 鞘糖脂的功能15-16
• 1.1.3 合成鞘糖脂的糖基转移酶16-17
• 1.2 棉铃虫Bt抗性机制及糖基转移酶基因介导的Bt抗性机制研究17-20
• 1.2.1 棉铃虫Bt抗性机制的研究17-19
• 1.2.2 糖基转移酶基因介导的Bt抗性机制19-20
• 1.3 本研究的目的与意义20-21
• 第二章 棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-4 的克隆和序列分析21-37
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 供试昆虫21
• 2.1.2 主要试剂21-22
• 2.1.3 仪器设备22
• 2.2 主要方法22-29
• 2.2.1 棉铃虫总RNA的提取22-23
• 2.2.2 第一条cDNA链的合成23-24
• 2.2.3 RACE-PCR所需cDNA第一链的合成24
• 2.2.4 PCR反应24-27
• 2.2.5 PCR产物纯化27-28
• 2.2.6 连接反应28
• 2.2.7 转化反应28-29
• 2.2.8 序列分析和系统发育树的构建29
• 2.3 结果与分析29-36
• 2.3.1 棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-4 的克隆及序列分析29-33
• 2.3.2 系统发育树的构建33-36
• 2.4 本章讨论36-37
• 第三章 棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-5 的时空表达谱分析37-44
• 3.1 实验材料37-38
• 3.1.1 供试昆虫37
• 3.1.2 主要试剂37
• 3.1.3 仪器设备37-38
• 3.2 主要方法38-40
• 3.2.1 棉铃虫不同组织和不同龄期总RNA的提取38
• 3.2.2 实时荧光定量PCR所用第一链cDNA的合成38
• 3.2.3 荧光定量PCR分析38-40
• 3.2.4 数据分析40
• 3.3 结果与分析40-43
• 3.3.1 RNA质量检测40
• 3.3.2 棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-5 在棉铃虫不同龄期的表达差异40-41
• 3.3.3 棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-5 在棉铃虫不同组织的表达差异41-43
• 3.4 本章讨论43-44
• 第四章 棉铃虫糖基转移酶HarmBre2、3 和5的亚细胞定位44-51
• 4.1 实验材料44-45
• 4.1.1 供试昆虫44
• 4.1.2 主要试剂44-45
• 4.1.3 主要仪器设备45
• 4.2 主要方法45-49
• 4.2.1 引物设计和PCR扩增45-46
• 4.2.2 PCR产物纯化及转化克隆载体46
• 4.2.3 融合表达载体的构建46-47
• 4.2.4 菌种保存47
• 4.2.5 质粒的提取47-48
• 4.2.6 Hi5细胞48
• 4.2.7 重组的质粒转染TH48
• 4.2.8 制片48-49
• 4.3 结果与分析49-50
• 4.3.1 棉铃虫糖基转移酶HarmBre2、3 和5的亚细胞定位49-50
• 4.4 本章讨论50-51
• 第五章 棉铃虫糖基转移酶基因Harmbre2-5 的RNAi研究51-55
• 5.1 实验材料51-52
• 5.1.1 供试昆虫51
• 5.1.2 主要试剂51
• 5.1.3 仪器设备51-52
• 5.2 主要方法52-53
• 5.2.1 siRNA的合成与稀释52
• 5.2.2 siRNA的注射及其沉默效率的检测52
• 5.2.3 生物测定52
• 5.2.4 数据统计分析52-53
• 5.3 结果与分析53-54
• 5.3.1 荧光定量PCR检测siRNA沉默效率53-54
• 5.3.2 Harmbre基因沉默后对棉铃虫Bt抗性的影响54
• 5.4 本章讨论54-55
• 第六章 Harmbre2-5 在棉铃虫抗感品系间的结构和表达水平差异分析55-59
• 6.1 实验材料55-56
• 6.1.1 供试昆虫55
• 6.1.2 主要试剂55
• 6.1.3 仪器设备55-56
• 6.2 主要方法56-57
• 6.2.1 Harmbre2-5 在棉铃虫抗感品系间的基因结构差异分析56
• 6.2.2 Harmbre2-5 在棉铃虫抗感品系间的基因表达差异分析56-57
• 6.2.3 数据处理57
• 6.3 结果与分析57-58
• 6.3.1 Harmbre2-5 在棉铃虫抗感品系间的基因结构差异分析57
• 6.3.2 Harmbre2-5 在棉铃虫抗感品系间的基因表达差异分析57-58
• 6.4 本章讨论58-59
• 第七章 全文结论59-61
• 7.1 主要结论59
• 7.2 研究展望59-61
• 参考文献61-68
• 致谢68-69
• 作者简介69

【参考文献】

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1 梁革梅,谭维嘉,郭予元;人工饲养棉铃虫技术的改进[J];植物保护;1999年02期

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本文编号：648230