一株红球菌（Rhodococcus sp. strain p52）对石油污染物的降解研究

发布时间：2014-12-30 15:30

 

【摘要】 石油是重要的一次能源之一,其应用范围不断拓展,在其开采、储运和使用过程中无法避免地会有泄油事故发生,造成上壤及水体的严重污染。石油类污染物具有较高的生物学毒性,进入环境后较难降解、消除,从而对生态系统造成极大的危害。由于微生物能够通过多种多样的代谢途径降解石油污染物,因此在石油污染物的治理中多采用生物法去除,此法见效快且成本低,在环境净化领域起到关键的作用。本文研究了一株二苯并呋喃(Dibenzofuran, DF)降解菌Rhodococcus sp.strain p52对不同链长的烷烃和芳香烃的降解性能。Rhodococcus sp. strain p52以利用直链烷烃(正十四烷、正二十四烷和正三十二烷)、支链烷烃(异十九烷)和芳香烃(萘和菲)等化合物作为唯一碳源和能源进行生长。经48h培养后,85.7%的正十四烷被降解,比降解速率达到3.8mg h-1g-1；在9-11天内,79.4%的正二十四烷、66.4%的正三十二烷、63.9%的异十九烷、接近100%的萘和55.3%的菲被降解,比降解速率分别达到20.5、14.7、20.3、16和12.9mg day-1g-1.通过分析各种烃的代谢产物得出,Rhodococcus sp. strain p52通过单末端、双末端和亚末端氧化的方式起始十四烷的降解；通过亚末端氧化的方式起始异十九烷的降解；通过单加氧方式起始萘的代谢,而通过单加氧和双加氧方式起始菲的代谢。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到编码烷烃羟化酶的基因序列,包括CYP185家族的细胞色素P450酶的基因和两个烷烃单加氧酶基因,将上述核酸序列测序分析后,与核酸及蛋白质数据库中对应的酶进行氨基酸序列比对分析,发现这些基因序列与其他已报道的革兰氏阳性菌中相应序列有较高的同源性,但两个单加氧酶AlkB-1和AlkB-2的氨基酸序列之间同源性仅有62%。这些基因在上述各石油烃化合物存在时的表达状况经反转录PCR实验得到验证,上述羟化酶基因的功能也通过大肠杆菌表达系统进行进一步确认。此外,研究表明与芳香化合物降解相关的降解质粒pDF01和pDF02具有同属和属间接合迁移性,经过连续传代培养,质粒pDF01和pDF02具有较好的遗传稳定性。上述结果表明,Rhodococcus sp. strain p52对石油污染物的生物修复具有较大的应用潜力。 

第一章前言

石油类化合物是环境中危害严重、污染周期长的工业污染物。在石油开釆、储运、加工和使用过程中不可避免地会有池漏油事故发生，对水体、土壤、大气环境及人类的生活造成了难以估量的损失。由于石油污染多由事故性或含油废水的大量排放引起，污染物质总量大，超出了污染区域生态环境的自净能力，一旦进入环境，难彻底清除。石油污染物具有较强的生物学毒性，可致癌、致畸、致突变，其中芳香烃类化合物对人和动物的毒性较大，尤其是以双环和三环为代表的多环芳烃毒性更大，已确认其具有较强的致癌作用，可以通过呼吸、皮肤接触、饮食摄入等方式进入人或动物体内，能溶解细胞膜，干扰酶系统，影响肝、肾等器官的正常功能，甚至引发癌变⑴。其中某些化合物还能够通过生物富集作用累积，为其他生物的生存和人类的健康埋下隐患。近些年来，随着工业、农业及釆矿业的不断发展以及新技术、新材料的不断开发引进，使得大量化学污染物，特别是人工合成化合物进入环境，使环境中的污染物变得更加复杂。由于这些化合物本身结构复杂，使其治理难度加大，在短时间内不能被有效清除，致使在环境中的存留时间可长达数年至数十年，对生态系统造成极大危害，严重地影响着人类的健康。因此必须寻求处理时间更快、处理效率更高的方法进行治理。石油污染的修复技术主要包括物理修复、化学修复、物理化学修复和生物修复。
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第二章Rhodococcu sp.strain  p52对直链烧经的降解

2.1材料与方法
菌株活化及培养：取出保存于-70度冰箱中的菌株甘油保藏管一支，划线接种于平板上，于30度温箱中培养20h后，挑取红球菌p52单菌落接种于10Ml LB液体培养基中培养20h。按1%接种量分别接种到两个含300ml液体培养基的锥形瓶中，恒温震荡培养，最后将其中一份菌体置于105度烘箱中供干直至质量不再发生变化，计算出细胞干重；将另—份菌体重新悬浮于中用于CFMM降解实验。

2.2结果与讨论
在只含菌液不含底物的对照组中，细胞的生长量基本无增加。在以各直链烷轻（正十四烧、正二十四烧和正三十二烧）为唯一碳源及能源的无机盐培养基中，Rhodococcu sp.strain  p52菌体的生长伴随着对各直链焼烃的消耗，由于实验中所用的烃类都不溶于水，在各烃的降解初期，细胞与底物之间的接触受限，妨碍了底物的代谢速度，使得菌体生长速度缓慢。尽管如此，与无菌对照组相比，实验组对中长链直链烧烃的降解仍非常明显，尤其是对正十四烧的降解，经48h培养后，正十四焼的浓度由177.5mg/l下降到25.3mg/l，Rhodococcu sp.strain  p52对难降解的长链烧烃（正二十四烧和正三十二烧）也表现出了较好的降解能力，培养11d后对它们的降解率分别达到了79.4%和66.4%。

第三章Rhodococcu sp.strain  p52对支链烧烃的降解............21
3.1材料与方法...........21
3.2结果与讨论...............22
3.3小结......................25
第四章Rhodococcu sp.strain  p52对芳香烃的降解..................27
4.1材料与方法................27
4.2结果与讨论.....................28
4.3小结............30
第五章石油烃降解基因的扩增及其转录活性分析..............31
5.1材料与方法............31
5.2结果与讨论...........34
5.3小结.......................37

第七章降解质粒PdF01和PdF02的接合迁移性和稳定性分析

7.1材料与方法
主要试剂
抗生素：氯霉素，链霉素，卡那霉素，土霉素，四环素，金霉素，红霉素，庆大霉素，强力霉素，购自上海生工生物。本章Rhodococcu sp.strain  p52以为供体菌，以与红球菌亲缘关系较近的同属或不同属微生物为受体菌，采用滤膜接合法进行接合实验。通过接合实验研究降解质粒从供体菌向不同受体菌中迁移的能力及其迁移的宿主范围。通过连续传代培养，考察质粒的遗传稳定性。

7.2结果与讨论
Rhodococcu sp.strain  p52对所有测试抗生素的抗性均不明显，紫红红球菌、地杆菌、大地两面神菌对链霉素有明显抗性，红串红球菌、蜡样芽孢杆菌对卡那霉素有明显抗性，铜绿假单胞菌对氯霉素有抗性，枯草芽孢杆菌对强力霄素有抗性，肿大地杆菌、金色节杆菌对所有测试抗生素的抗性均不明显。质粒不稳定的类型包括质粒分离不稳定和质粒结构不稳定。质粒分离不稳定性是指由于在细胞分裂过程中发生的质粒的不平均分配而造成的质粒丢象现象；质粒结构不稳定性是指由转位作用和重组作用所引起的质粒的重排和缺失。因此，质粒的稳定遗传需要两个必要条件：一是平均每个世代每个质粒至少发生一次复制；二是细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配到两个子细胞中去。由于时间的限制本章的研究主要涉及质粒分离不稳定性，尚有待于进一步针对质粒结构不稳定性开展研究。
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第八章结论与建议

本研究以一株二苯并咲喃降解菌Rhodococcu sp.strain  p52为研究对象，研究了其对不同链长的烧烃和芳香烃的降解性能；克隆分析了Rhodococcu sp.strain  p52中与石油化合物降解相关的经化酶基因序列并通过逆转录验证了每种单加氧酶在不同降解底物存在时的表达活性。通过构建轻化酶基因的大肠杆菌表达系统，验证了各降解基因产物转化烃的功能。为进一步认识各石油化合物的降解特征，收集各化合物的主要代谢产物，归纳了烧烃和芳香烃可能的降解途径。考察了Rhodococcu sp.strain  p52中降解质粒在同属菌株或属间接合迁移性及其遗传稳定性。得到的主要结论如下：通过对各烃代谢产物及代谢途径分析推测Rhodococcu sp.strain  p52通过单末端、双末端和亚末端氧化的方式起始十四烧的降解；通过亚末端氧化的方式起始异十九烧的降解；通过单加氧方式起始萘的代谢，通过单加氧和双加氧方式起始菲的代谢。

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参考文献:

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本文编号：10946