非综合征性腭裂患者差异miRNA与靶基因分析及人心肌实时RT-PCR内参标志物在死亡早期稳定性的评估

发布时间：2017-11-09 09:10

  本文关键词：非综合征性腭裂患者差异miRNA与靶基因分析及人心肌实时RT-PCR内参标志物在死亡早期稳定性的评估

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【摘要】：上篇 研究背景 唇腭裂(Cleft lip with or without cleft palate, CL/P)是一种常见的出生缺陷,包括先天性唇裂(cleft lip, CL)和先天性腭裂(cleft palate, CP).根据是否伴发其它出生缺陷,CL/P又可分为综合征性唇腭裂(syndromic cleft lip and/or palates,SCL/P)和非综合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft Lip and/or palates, NSCL/P)。其中,80%-85%的CP属于非综合征性腭裂(nonsyndromic cleft palate, NSCP),临床表型相对单一。唇腭裂在全世界的发病率为1/500-1/1000。我国为唇腭裂的高发国家,发病率为0.182%,近几年的数据显示我国唇腭裂的发病数呈居高不下的趋势,居我国出生缺陷前五位。唇腭裂给患者造成包括外貌、吞咽、语音以及心理等方面诸多不利的影响,也给家庭和社会带来经济负担。目前的研究认为,CL/P是由环境因素和遗传学因素相互作用引起的复杂性遗传病。但是,CL/P的具体发病机制尚不清楚。 每10000个新生儿中约有1.3-25.3个会出现NSCP的表型。NSCP亦是受遗传与环境多因子影响的疾病。已有研究发现NSCP的候选基因,如WANG等发现了ROR2基因上的3个SNPs(rs7858435,rs10820914和rs3905385)与亚洲人NSCP的发生有显著的相关性；Sairee等在人类NSCP病人中发现了PDGFRa的突变；FitzPztrick等在NSCP病人的2q32-q33异位突变区确定了候选基因SATB2。然而,阳性家族史所占的比例较少,国外报道的CL/P阳性家族史比例为20%以上,而国内比例低于国外,一般为5%-10%。多数病例并不能用遗传学来解释,因此众多学者研究了遗传学因素以外的相关因素如环境因素、生活质量等对腭发育的影响,其中表观遗传学对腭发育的影响成为了研究的热点。Abbott等发现激素类药物如泼尼松、地塞米松等能引起腭突发育过程中表皮生长因子(EGF)和转化生长因子(TGF)及其受体分布的改变,引起腭裂的发生。石冰等的研究结果也显示地塞米松可以诱导小鼠形成腭裂,同时采用维生素B6、维生素B12可预防腭裂畸形的发生。在1niRNAf方面,研究显示miR-140通过调控Pdgfra信号通路在斑马鱼腭的发育中发挥作用；Shin等用原位杂交的方法检测到了小鼠腭间充质中miR-200b、 Smad2和Snail的表达,但当腭弓融合后,围绕在融合部位的间充质区域不在有miR-200b的表达。体外实验发现,异位表达的miR-200b导致了转化生长因子-β(Tgf-β)信号通路调节因子Smad2(?)(?)Snail表达的抑制,以及腭突融合区域细胞凋亡与增殖的改变。结果显示miR-200b通过调控Tgf-β信号通路中的关键因子Smad2和Snail而影响腭的发育,特别是腭突的融合。这些研究都从表观遗传学的角度揭示了腭的发育分化机制,但研究都是基于动物实验,至今并未见基于人类的、研究NSCP患者差异miRNA及其发病机制的相关报道。 表观遗传学主要涉及非编码RNA、DNA甲基化、基因组印记、随机染色体(X)失活、染色体重塑以及组蛋白修饰改变等。在遗传与环境共同影响发病的疾病研究中,表观遗传学已受到众多学者的关注。其中,miRNA已经成为了研究热点。miRNA是一类长约22-25nt的非编码功能小、RNA。成熟的miRNA通过与靶基因3’非翻译区(3'-UTR区)形成不完全配对,从而抑制靶基因翻译,或形成接近完全的配对,导致靶mRNA降解。miRNA在很多生物的生理和病理过程中发挥重要作用,影响细胞发育、增殖、凋亡,在胚胎发育中发挥重要的作用,如已有研究发现niRNA(?)工蛋白编码基因Dicer在小鼠心脏的特异性敲除会导致胎鼠心脏的严重畸形。小鼠心肌特异表达基因miR-1的敲除会导致50%的小鼠因心室隔膜形成异常而造成死胎,15%的小鼠在出生后2-3月会因严重的心脏缺陷而死亡。对niRNA的研究将有助于揭示胚胎畸形的发病机制。 遗传与环境因素共同影响CL/P的发生,虽然一些基因突变可导致CL/P的发生,但遗传学因素以外的例如环境因素等作为独立的发病因素,异或通过环境-基因相互作用的方式也能导致CL/P的发生。因此,表观遗传学的改变在CL/P的发生过程中的作用逐渐受到重视。然而,目前尚未见关于人类CL/P差异miRNA的研究。为此,我们选取临床表型相对单一的NSCP病人作为研究对象,探讨与人类NSCP相关的差异miRNA及其靶基因,以期从表观遗传学的角度揭示NSCP可能的发病机制,为人类CL/P预防干预的政策制定提供直接的依据。 研究目的 寻找非综合征性腭裂相关的miRNA及其靶基因。 方法和结果 (1)本实验从河北市邯郸中心医院与云南省微笑列车行动中收集到50例被诊断为NSCP的患者矫形手术后的软腭组织样本,从复旦大学上海医学院法医学系收集到20例正常对照的软腭组织样本,均来自道路交通事故案例。收集到的样本立即放入RNA Later保护液(Ambion, USA)中,于-80℃保存。所有的样本收集均受伦理委员会批准。 (2)采用TRIzol法抽提样本RNA,经检测(?)RNA质量合格后,应用佰真公司Agilent GeneChip miRNA Array芯片对6例正常对照样本和10例非综合征性腭裂患者软腭组织样本进行差异miRNA初步筛选。根据软件运算和人工比对,我们共选定了12个候选miRNA进行下一步的验证工作。 (3)我们在20例正常对照样本和50例非综合征性腭裂患者软腭组织中用实时定量PCR方法验证芯片筛选结果,结果经Mann-Whitney U检验统计发现4个miRNA (miR-1246、miR-1323、miR-93和miR-143*)在对照组和病例组中存在表达差异,p0.05。 (4)为了检验4个(?)niRNA是否是非综合征性腭裂患者的危险因素,我们采用风险性分析计算了OR值(odds ratio),统计结果分别为：miR-1246(OR=13.67,95%CI:2.480-75.30), miR-1323(OR=12.0,95%CI:1.791-80.42)、miR-93(OR=9.75,95%CI:1.642-57.89)、miR-143*(OR=5.25,95%CI：1.021-27.00)。结果显示(?)niR-1246、miR-1323和]niR-93的表达上调,miR-143*的表达下调是非综合征性腭裂发生的高危因素。 (5)因为miRNA的表达具有时空特异性,在发育的不同阶段存在表达差异。并且由于收集到年龄相匹配的样本存在一定的困难,我们的实验样本存在年龄的差异。为了排除年龄差异对检测结果造成的影响,我们分析了4个miRNA的表达与年龄之间的相关性,经过对Pearson's(?)目关系数的统计,我们发现检测到的4个miRNA的表达与年龄无关,排除了年龄因素对验证结果的影响。 (6)研究发现非综合征性腭裂患者男性多于女性,因此我们分析了检测到的4个miRNA与性别之间的相关性。结果发现4个miRNA的表达在男性与女性之间无统计学差异,不受性别因素的影响；但是我们发现在NSCP组4个miRNA的表达水平与男性有显著的相关性,这一发现支持流行病学研究结论：非综合征性腭裂更多发于男性。 (7)为了寻找1miRNA对非综合征性腭裂可能的发病机制,我们通过生物信息学软件预测了4个差异表达：miRNA可能的靶基因,并通过实时定量PCR的方法对靶基因进行了验证。最终我们确定了2个靶基因,分别是FGFR2与WNT5A。其中,FGFR2S是miR-1246、miR-1323、miR-93的靶基因,表达下调；WNT5A是miR-143*的靶基因,表达上调。 总结与展望 我们采用高通量miRNA Array芯片的方法,在非综合征性腭裂患者中发现了4个差异表达的miRNA。其中,1miR-1246、miR-1323和1miR-93表达上调,miR-143*的表达下调。并且通过预测与验证发现FGFR2是miR-1246、miR-1323和miR-93的靶基因,与正常对照组相比在NSCP病例组中表达下调；WNT5A是miR-143*的靶基因,与正常对照组相比在NSCP病例组中表达上调。 虽然,本实验从表观遗传学的角度发现了与NSCP相关的(?)(?)iRNA及其靶基因,但是,miRNA对靶基因的调控效率以及靶基因所在信号通路在腭的发育中发挥的调控作用这些都是亟待进一步研究的内容。进一步的研究将在模式生物的基础上、从信号分子调控的角度深入揭示NSCP的发病机制。发病机制的阐明将为先天性腭裂的早期预防及妊娠期的干预治疗提供新的思路。 下篇 研究背景 死亡时间(postmortem interval, PMI)推断是法医学最重要的任务之一,准确的PMI推断,有利于迅速确定涉案罪犯以及排除嫌疑人。传统的PMI推断方法主要根据尸体现象(如尸斑、尸冷、尸僵、角膜混浊等)、胃内容物的消化程度、蝇蛆的生长规律以及植物根系和苔藓类生物的生长变化等。但这些方法都容易受到外界环境的干扰。分子生物学的飞速发展为这一课题提供了新思路,其中尸体样本中的核酸分析技术的应用,特别是通过实时RT-PCR的方法研究核酸降解规律与PMI之间的关系已成为研究者的焦点。由于实时RT-PCR方法得到的结果必须依赖于准确的内参基因的标准化,才能排除个体之间的差异,因此寻找稳定的用于PMI研究的内参基因就显得十分必要。 本实验选择β-actin、GAPDH、B2M、U6、18SrRNA和hsa-mir-1共6个常用的内参分子标志物。通过实时定量PCR技术对早期死亡时间心肌组织中各内参分子标志物的转录水平进行检测,分析内参分子标志物在早期死亡时间内的稳定性。旨在为心肌组织中早期死亡时间推断的实时定量PCR研究提供准确稳定的内参分子标志物。 研究目的 寻找用于早期死亡时间人心肌内实时定量PCR稳定的内参分子标志物。 方法和结果 (1)与上海市公安局刑事科学技术研究所合作,收集10例具有不同死亡时间的案例样本,尸体的外界环境相似(尸体解剖均在室内存放,平均室温25℃)且尸体并没有呈现肉眼可见的腐败现象。每例尸体都准确的记录死亡时间(4.3h-22.3h)、死因等。取左心室肌肉组织50-100mg,分装于RNAlater保护液(Ambion公司,美国),立即置于-80℃冻存、备用。以上样本收集均受伦理委员会批准。 (2)选取6个常用的管家基因及与心脏发育相关的miRNA作为待评估的内参分子标准物,并设计引物,分别是β-actin、GAPDH、B2M、U6、18SrRNA和hsa-mir-1。 (3)采用TRIzol法抽提样本总RNA、cDNA合成,应用实时定量PCR检测6个分子标志物在不同的死亡时间的表达量。 (4)通过genormPLUS程序对6个选取的内参分子标志物在不同死亡时间的表达量进行统计处理,计算其表达稳定度平均值M。结果显示U6的表达稳定度平均值M最小,表达最稳定。 (5)为了进一步检验U6表达的稳定性,我们分析了性别、年龄与死因与U6表达的相关系。经统计学分析,结果显示U6的表达在男性与女性之间无统计学差异,同时U6的表达与年龄、死因无相关性。揭示在早期死亡时间U6的表达量不受性别、年龄与死因的影响,是理想的用于早期死亡时间人心肌研究的实时定量PCR内参标志物。 结论与展望 在人心肌内U6的表达在早期死亡时间内最稳定,并且不受年龄、性别与死因的影响,是一个理想的使用实时定量PCR的方法研究死亡时间推断的内参标志物。 进一步的研究将在扩大样本的基础上,在其他常用检材组织,比如皮肤、骨骼肌、脑、脾等进行研究,寻找每个组织最适合的内参,以期运用最稳定的内参、采用实时定量PCR的方法研究死亡时间与核酸降解之间的规律,并且建立多指标降解规律与死亡时间之间的数学模型。这将会使死亡时间推断更加精确,更有利于法医实际工作的开展。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R782.21

【参考文献】

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本文编号：1161206