奥奈达希瓦氏菌气液界面生物膜的生长及其机制研究

发布时间：2020-07-24 10:52

【摘要】： 奥奈达希瓦氏菌(Shewanella onedensis:S.onedensis)具有代谢方式的多样性和灵活性,是生物修复与生物进化领域研究的模式菌株。因为希瓦氏菌对不溶性金属的还原性,以及在生物燃料电池等方面潜在的应用前景,使得希瓦氏菌生物膜的研究成为近年来该领域研究的热点。已报道的文献对该菌在固体表面形成生物膜的研究较多,但在气液界面形成生物膜的研究未见报道。 本论文首次构建了Shewanella onedensis MR-1静置培养条件下形成气液界面生物膜的生长体系,结合微生物生理学、生物化学与分子生物学的研究方法对气液界面生物膜形成的条件、必需因素和分子机制进行了较系统的研究。主要取得了以下结论和认识: (1)构建MR-1气液界面生物膜生长的培养体系,探讨该生物膜生长的动力学和生长特征。 研究了静置培养生长时气液界面生物膜的生长动力学和培养体系的氧气条件等生长特征。实验表明气液界面生物膜仅在好氧条件下形成,且形成生物膜时浮游细胞的临界浓度(OD_(600))为0.23,浮游细胞浓度(OD_(600))超过0.23后,细胞开始粘附到气—固—液界面,然后扩展到气-液交界面成膜。在厌氧静置培养时,即使浮游细胞密度(OD_(600))达到0.4,液体表面也没有观察到生物膜的形成,说明氧气条件和一定浓度的浮游细胞是气液界面生物膜形成的重要条件。 (2)研究胞外基质的主要成分,观察生物膜的微观形貌特点。 胞外基质是生物膜的重要组成部分,一般包括蛋白质、纤维素和DNA等组分。本文实验发现,大于100μg/mL的蛋白酶K不仅能阻止生物膜的形成,而且可以破坏生长成熟的生物膜。而DNaseⅠ(0-1000U/mL)和纤维素酶(0-100U/mL)对生物膜的形成没有影响,也不能破坏成熟的生物膜。说明而纤维素和DNA不是生物膜基质中的主要成分,蛋白质对生物膜形成与稳定有重要作用。所以,沦文对蛋白分泌系统及其分泌的蛋白进行了进一步的研究。SEM分析显示成熟的MR-1气液界面生物膜是由多层密集细胞组成,膜上细胞从顶端产生直径约10nm,几到几十微米长的纳米线。 (3)应用MR-1全基因组cDNA芯片,揭示同一培养体系中气液界面生物膜与浮游细胞表达的各种差异。 为了研究气液界面生物膜与浮游细胞的差异和生物膜形成的机理,文章利用MR-1全基因组cDNA芯片研究了同一培养系统中气液界面生物膜与浮游细胞表达的差异。芯片分析结果表明:1)浮游细胞与气液界面生物膜细胞表达差异的基因涉及MR-1生理代谢的各个方面,占总编码序列的19.0%;2)在生物膜细胞中,所有三羧酸循环基因和ATP合成酶基因都上调,13个编码NADH脱氢酶的基因有12个上调;与厌氧呼吸有关的基因在浮游细胞中表达上调;说明气液界面生物膜细胞是以有氧呼吸为主,浮游细胞以厌氧呼吸为主;(3)蛋白运输基因在两种细胞中表达差异显著,特别是铁与血红素吸收与运输的基因在生物膜中一致上调,采用q-RT-PCR验证了芯片杂交实验的可靠性,说明铁在生物膜的形成过程中有某种程度的作用。 (4)系统研究了EDTA和Fe、Ca、Mn、Cu、Zn、Mg等金属离子分别对MR-1气液界面生物膜形成的影响 首先,构建了△hmuT和△hugA两株铁运输基因突变株,发现突变株与野生株形成气液界面生物膜的能力一样;说明铁对MR-1生物膜形成贡献较小,cDNA芯片识别的铁运输基因不是与生物膜的形成功能特异性相关,它们的表达差异是对气液界面生物膜生成环境的适应性响应。 其次,研究了EDTA和其它金属离子对气液界面生物膜形成的作用。实验发现:0.3mM EDTA完全抑制了生物膜的生成;大于0.3mM Ca(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)能完全消除EDTA对生物膜形成的抑制;而Mg(Ⅱ)加入含EDTA的培养液不能恢复生物膜的形成;说明前四种金属离子在生物膜形成中有重要的促进作用。0.3mM Fe(Ⅱ)或Fe(Ⅲ)加入含EDTA的培养液,MR-1生物膜形成量仅为没有EDTA处理的42.5%和40.8%,进一步验证了铁对MR-1生物膜形成贡献较小。 (5)探讨与生物膜形成相关的蛋白及其分泌通道 首先,采用RT-PCR对MR-1基因组中依次排列的rtxB、emrA、aggA和ompA基因转录关系进行分析,结果表明它们同属于rtxB操纵子。利用生物信息学的方法对rtxB操纵子的可能启动子序列进行了预测和分析。其次采用基因同源重组方法构建了Ⅰ型蛋白分泌系统三个基因的突变株△rtB,△emrA和△aggA,分泌系统上游基因突变株△rtx,下游基因突变株△ompA。 实验表明:△rtx,△rtxB,△emrA和△aggA四株突变株都丧失了在气液界面形成生物膜的能力,它们在固体表面生成生物膜的速率比野生株慢,说明Ⅰ型蛋白分泌系统及其上游Rtx毒素蛋白与气液界面生物膜形成相互关联。在生物膜形成、上清液互补、群集运动、SEM等分析中△rtx突变株与Ⅰ型蛋白分泌系统突变株表型高度一致,说明Rtx毒素蛋白通过Ⅰ型蛋白分泌系统分泌至胞外,促使生物膜的形成。 最后,建立了Rtx毒素蛋白通过Ⅰ型分泌系统分泌到膜外,与Ca~(2+)结合导致细胞间的连接和成膜的模型。 (6)研究c型细胞色素对气液界面生物膜形成的影响和机制 c型细胞色素是电子传递链上重要组分,对其研究主要集中在厌氧呼吸系统,研究其对气液界面生物膜的影响有助于探明生物膜的形成机理。研究了12株c型细胞色素突变株对气液界面生物膜形成的影响。首次研究并发现△SO4666完全丧失了成膜能力;△SO1777,△SO1782,△S02361和△SO2363成能力下降。研究了12株c型细胞色素突变株在生物膜细胞和浮游细胞中的竞争生长。生物膜细胞或浮游细胞竞争生长后,△SO1777,△SO1782,△SO2361和△SO2363四株菌的细胞数量都减少,说明它们通过影响静置生长时浮游细胞的生长速度影响生物膜的形成。扫描电镜观察丧失成膜能力的△SO4666突变株表面结构,发现细胞表面纳米线缺失;△SO4666变株群集运动能力比野生株弱;说明△SO4666突变株由于纳米线的缺失,导致群集运动能力降低以及气液界面生物膜形成能力的丧失,纳米线是MR-1菌株气液界面生物膜形成必需的元素。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：X703
【图文】：

科技工作者利用不同的方法研究了金属离子在生物膜中的存在形式和作用机理，试图运用各种化学的、生物的理论，从细胞和分子层面来解释生物膜与金属的相互作用〔’7〕(图1一3)。金属离子与细胞或其分泌物质结合，在生物膜中的存在方式主要有以下几类:(l)生物膜胞外基质。多糖、蛋白质、 DNA以及它们的单体作为细菌生物膜胞外聚合基质的主要组分，它们通过带负电核的轻基，梭基，琉基等，和金属元素通过相反电荷间的静电相互作用、甚至是成键作用紧密结合，稳定生物膜的结构〔川。(2)细菌表面结构。细胞膜与细胞壁能提供许多离子结合位点与金属离子结合，例如细胞壁上脂肪酸糖脂「以2:l]。(3)细菌代谢终产物。微生物的很多代谢终产物可以与金属离子反应，产生金属沉淀复合物，如硫化物或碳酸盐;散布在活细胞间的死亡细胞是生物膜中容易被忽视的组份〔‘了〕，它具有化学反应活性，能够提供沉淀或络合金属的位点;另外

C伪栩扭咖助容爪mSu扬蕊侧叨的图1一2成熟细菌生物膜的结构Fig.l一 2Maturebiofilmstructureeontaininglayers， ineludingbulkofbiofilm，linkingfilm， eonditioningfilm， andthesubstratumtowhiehthefilm15attached. 1.2.2金属离子对生物膜形成的作用机理近年来，科技工作者利用不同的方法研究了金属离子在生物膜中的存在形式和作用机理，试图运用各种化学的、生物的理论，从细胞和分子层面来解释生物膜与金属的相互作用〔’7〕(图1一3)。金属离子与细胞或其分泌物质结合，在生物膜中的存在方式主要有以下几类:(l)生物膜胞外基质。多糖、蛋白质、 DNA以及它们的单体作为细菌生物膜胞外聚合基质的主要组分

革兰氏阳性菌通常通过专一的ABC(ATPbindingCaSSette)蛋白分泌肤信号分子，肤信号分子被同源双组分转导信号的感应激酶蛋白分子识别，与胞浆反应调节蛋白相互作用，产生磷酸化与去磷酸化的系列反应而诱导相关基因的表达。葡萄球菌群体感应系统中的辅助基因调节因子能被肤信号分子激活，调控数种细菌蛋白的表达，增强多种毒力因子的分泌，影响生物被膜生长和发展[45〕LuxS依赖的群体感应信号在细菌生物被膜形成过程中起重要的作用。在链球菌突变体研究中发现了以又交变株形成的生物膜结构发生了改变，质地粗糙，基质间间隙增大，呈现颗粒状外观〔侧。细菌群体感应系统，使作为单细胞生物的细菌具备了部分类似多细胞生物的功能，让细菌在应对环境挑战时，能协调一致，以群体的力量共同完成一些单个或浮游状细菌无法完成的功能。影响生物膜结构的因素很多，包括水力学条件、胞外多聚物的数量，细菌的移动性以及金属离子的种类和浓度等等，细菌群

【引证文献】

相关期刊论文 前1条

1 苏艳;段继周;段东霞;蔺存国;张杰;侯保荣;杨东方;;材料表面性质对微生物附着行为的影响[J];海洋科学;2012年12期

相关硕士学位论文 前1条

1 苏艳;海洋生物附着过程与防污评价技术的研究[D];上海海洋大学;2012年

本文编号：2768738