先天性心脏病血浆microRNA表达谱及与GATA4靶序列单核苷酸多态性的关联研究

发布时间：2020-07-29 08:50

【摘要】：研究背景出生缺陷已成为影响我国人口素质和群体健康水平的重要公共卫生问题。出生缺陷种类繁多,先天性心脏病(congenital heart diseases,CHDs)是我国围产儿最高发的畸形,也是导致新生儿及婴儿死亡的最重要的原因。国外报道先心病约占全部重要出生缺陷的1/3,活产儿先心病平均发病率为9.1‰(95%CI：9.0‰-9.2‰),其中亚洲国家最高,为9.3‰(95%CI：8.9‰～9.7‰)。我国2011年的监测报告显示CHDs的发生率为40.95/万,并呈逐年增长的趋势。CHDs是指胎儿期心脏及大血管发育异常而致的心血管畸形。通常可将CHDs分为三大类：紫钳型心脏病、左侧堵塞性缺陷和隔膜缺陷。临床上主要的CHDs诊断包括房间隔缺损(：itrial septal defect, ASD)、室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)、动脉导管未闭(patent ductus arteriosus, PDA)、法洛氏四联症(tetralogy of Fallot, TOF).大动脉转位(transposition of the great arteries, TGA)、肺动脉闭锁(pulmonary valve atresia, PA)、主动脉缩窄(coarctation of the aorta, COA)和三尖瓣闭锁(tricuspid atresia, TA)等。先心病最常见的类型是隔膜缺损,其中室间隔缺损(VSD)约占CHDs的20%。因此,进一步提高先心病的早期诊断水平、加强病因及其机制研究、提出科学的防治措施是降低我国整体出生缺陷发病率的保证。微R NA (microRNAs)是一种转录后调节因子,长度介于18～22个核苷酸的单链、非编码的小分子RNA。microRNA已成为当前生命科学领域最受关注的非编码调控RNA,多数nicroRNA通过与靶基因3’非翻译区(3'Untranslated Region,3'UT R)碱基配对结合,在mRNA或蛋白水平抑制基因表达,影响细胞的生长、代谢、分化和凋亡,进而参与生物体的生长发育。microRNA几乎调控所有与基因表达有关的生物学过程。研究发现,microRNA在心血管疾病的发生与发展方面发挥着重要的作用,参与调控胚胎心脏和血管的发育,在心脏形态发生、心肌细胞生长及分化过程中具有重要的功能。近年来,随着在血浆中发现了稳定存在的nicroRNA, microRNA的研究聚焦在血浆]microRNA与疾病的关系上。通过对患者和正常人群血浆nicroRNA的检测和对比后,发现了一批可以用于疾病临床检测的microRNA。作为新的检测生物标志物,血浆nicroRNA具有方便、快捷以及较高的准确性等优点。目前,由于缺乏针对先天性心脏病的特异性较高并且较为简易的早期检测手段,CHDs患儿较难被早期发现。因此,本研究试图通过采用microRNAs表达谱芯片对VSD患者血浆microR A表达进行筛选,找出其与正常对照人群差异表达的microRNA,并且运用RT-PCR技术对部分明显差异表达的microRNA进行检测,验证芯片结果的可靠性,寻找可以作为临床诊断标志物的血浆microRNA,评估其在临床应用中的实际价值,构建先心病早期诊断模型。运用生物信息学等手段进一步对差异表达的nicroRNA下游调控的靶基因进行预测,分析其生物学功能,为阐明CHDs在分子水平上的发病机制提供线索。CHDs病因复杂,至今尚未完全明确。一般认为CHDs是由遗传因素和环境因素共同作用于高度调节的心脏发育过程而导致。大量的研究表明,人群遗传背景的基因多态性可以通过影响相关基因的功能,对疾病易感性发挥重要的作用。随着人类基因组计划的完成,以单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)为标记进行常见复杂疾病的遗传易感性研究取得了巨大的进展,其中包括候选基因在内的关联分析(Candidate gene Association Study)已成为后基因组时代复杂疾病遗传学研究的热点之一。因此,结合中国山东省先天性心脏病人群病例样本和相应的临床资料,进行SNPs与先心病的关联研究,分析先心病的病因及发病机制,发掘先心病易感的遗传标志,对提高先心病的预防和治疗水平具有重要的意义。microRNA主要通过其“种子区(2-8碱基)”与靶基因mRNA3' UT上的靶序列(target sequence)互补结合,发挥其反式作用因子的功能,引起mRNA的翻译抑制,影响基因表达剂量。结合位点的序列决定了microRNA发挥作用的特异性。靶序列单核苷酸的改变就会干扰或破坏microRNA与其结合以及转录后调控作用,影响基因的表达和功能。因此,候选基因3’UTR的]microRNA靶序列SNPs可能会改变个体疾病易感性。尽管国内外在基因多态性和CHDs易感性方面做了大量的研究工作,并鉴定出一些可能致病的多态位点,但不同研究中结果不一致,且缺乏相关的分子生物学功能验证,仍有许多问题尚待解决。另外已有研究的基因区域更多地在基因编码区,关注氨基酸变化导致的基因功能异常对易感性的影响,对基因非编码区尤其nicroRNA靶序列多态性所导致的基因表达剂量与CHDs关系的研究还较少。因此,我们从microRNA对候选基因3’UTR区域靶序列结合的角度,从microRNA差异表达谱入手,综合应用生物信息学数据库筛选重点基因靶序列上的功能性SNPs。选择与丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK signaling pathway)密切相关的重要转录因子GATA4作为候选基因,针对筛选出的靶序列SNPs,应用病例-对照研究方法进行相关SNPs与CHDs的关联分析。在此基础上,应用细胞和分子生物学方法对CHDs有关联的SNPs进行功能学实验,分析多态介导的microRNA通过GATA4表达调控引起CHDs发生的可能分子机制。通过上述研究提出相应的CHDs预防策略和措施,争取能进一步将CHDs的出生缺陷预警提前到围产期甚至更早,为我国优生优育政策的制定提供依据。研究目的1.筛选并验证室间隔缺损患者血浆中表达差异的microRNA;评价血浆microR NA在先心病早期诊断中的临床应用价值以及作为先心病分子诊断标志物的可行性,建立临床早期诊断模型。2.结合生物信息学技术对差异表达的]microRNA进行靶基因预测以及功能注释和pathway注释,构建microRNA与基因的调控网络；筛选先心病相关基因的microRNA靶序列中功能性SNPs及其参与调控的microRNA,为开展系统性的microRNA靶序列与先心病的关联研究以及机制分析提供参考。3.研究GATA4基因3’UTR靶序列的8个功能性SNPs与先心病人群易感性的关联；采用荧光素酶报告基因功能实验检验S NP rs3203358 (1521 C G)影响miR-583对GATA4基因的结合和表达调控,分析多态介导的microRNA调控靶基因引起先心病发生的可能机制。研究方法1.研究对象采用以医院为基础的病例-对照研究方法开展本次研究。于2012年6月-2013年11月分别在济南市儿童医院和泰安市妇幼保健院心血管外科收集就诊和治疗的0.4-6岁先天性心脏病患者作为病例组；并同期于上述医院查体中心收集查体儿童作为对照组。所有研究对象出生地均为山东省。本研究通过了相关医院伦理委员会的批准。1)血浆microRNA差异表达谱检测：共收集病例组85例和对照组80例,分三个阶段进行检测：首先选择室间隔缺损(VSD)病例及其匹配对照各3例,应用microRNA全基因组表达谱芯片进行初筛；然后扩大样本量(20例病例vs 15例对照)对选定的8个差异microRNA使用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)进行芯片结果的验证；最后进一步扩大样本(62例 vs62例)进行qRT-PCR测定,筛选先心病早期诊断的生物标志物。2)GATA4基因microRNA靶序列SNPs与先心病的关联研究：参考估计的样本含量,选取309例先心病病例和408例对照进行基因型检测,研究GATA4基因3’UTR靶序列的SNPs与CHDs易感性关联。2.样本采集于入院次日清晨空腹采集研究对象静脉血标本4ml,其中2ml装入EDTA抗凝管,保存于-20℃冰箱中,一周内用酚-氯仿法提取基因组DNA。另外2ml外周血4000rpm离心10分钟,吸取上清,按每管100ul分装,置于-80℃保存备用。3.microRNA全基因组表达谱芯片筛选采用7th generation of miRCURYTM LNA Array (v.18.0) (Exiqon, Vedbaek, Denmai k)全基因组表达谱芯片技术,将3对血浆标本委托上海康成生物工程有限公司进行nicroRNA芯片检测。应用GenePix Pro 6.0 software (Axon)分析表达谱芯片结果,列出与对照组相比,表达上调或下调大于1.5倍且有统计学差异(P0.05)的microRNA,作为候选的血浆microR NA差异表达谱。4.实时定量PCR验证抽提血浆总RNA逆转录合成cDNA后,以miR-93为内参照,各样品的目的nicroRNA和内参(miR-93)分别进行Realtime PCR反应。数据采用2-△△CT法进行分析。5.诊断模型的建立和评价选择8个重要差异表达的microRNA,利用124例样本的RT-PCR检测数据对比表达差异获得具有临床诊断意义的血浆microRNA,建立多指标的logistic回归模型。应用MedCalc软件进行ROC曲线分析评价诊断模型的价值。6.靶基因分析和靶序列SNPs筛选运用生物信息学分析方法对microRNA差异表达谱进行靶基因预测、聚类分析。基于Gene Ontology(GO)和KEGG数据库,对靶基因进行功能注释以及Pathway注释。利用Cytoscape2.8.3软件构建microRNA与靶基因的调控网络。通过分阶段数据挖掘进行候选基因microRNA靶序列功能性SNPs及参与调控的microRNA的分析和筛选。7.GATA4基因3’UTR区域靶序列SNPs检测利用Sanger双脱氧氢测序技术(Sanger dideoxy sequencing technology of hydrogen)对GATA4基因3’UTR区域8 个 SNPs位点(rs867858、rs1062219、 rs884662、rs904018、rs12825、rs12458、rs1062270和rs3203358)进行病例组和对照组的基因型检测,采用χ2检验分别比较不同基因型及等位基因频率,以非条件Logistic回归模型计算比值比(OR)及其95%可信区间(95%Cl),分析各靶序列SNPs与CHDs及各临床类型发病风险之间的关联,并进行连锁不平衡和单倍型分析。8.双荧光素酶报告基因实验构建pMIR-GATA4野生型和突变型(rs3203358,1521 CG)重组表达质粒以及miR-583 mimic,共转染人源胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney 293 cell, HEK-293)培养后,运用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度,检验miR-583与GATA4不同等位基因型3’UTR重组质粒结合情况,分析miR-583是否通过该突变位点影响GATA4基因的表达活性。研究结果1.先心病患者血浆差异nicroRNA s筛选及验证利用miRCURYTM LNA Array (v.18.0) micro RNA芯片技术检测了3例室间隔缺损(VSD)患者和3例健康对照血浆中的microRNA表达特征,初步确定了VSD差异microRNA表达谱。芯片杂交初筛结果显示：与对照组相比,有36个表达差异的microRNA(P0.05),其中21个microRNA在VSD患者表达显著下调,表达显著上调的microRNA有15个。选择出8个重要的差异表达microRNA进行随后的两阶段大样本qRT-PCR验证,检测到5种血浆nicroRNA(let-7e-5p、 miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433 和 miR-487b)在VSD中的表达差异具有统计学意义,可以选择作为具有VSD早期诊断意义的生物标志物。2.先心病血浆microRNA诊断模型及其评价采用ROC曲线(受试者工作特征曲线,receiver operating characteristic curve)分析5种血浆microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p.miR-433 和 miR-487b)表达水平对于VSD的诊断效率。上述5种血浆microRNA的ROC曲线下面积(Area Under Curve, AUC)分别在0.678至0.832之间,其中miR-222-3p的ROC曲线下面积最大为0.7832。建立多指标Logistic回归分析模型,5种血浆microRNAs联合模型可提高VSD的诊断效率,ROC曲线下面积达到0.953,灵敏度及特异度分别为0.839和0.952；3种血浆microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、 miR-222-3p)联合诊断模型,ROC曲线下面积达到0.910,灵敏度及特异度分别为0.823和0.903。3.差异nicroRNAs靶基因预测应用niRBase、miRanda和 TargetScan三个靶基因预测软件对病例组和对照组表达差异的36个microRNAs靶基因进行预测。合并三个预测数据库的交集,得到15个先心病差异表达microRNAs的447个预测靶基因,差异microRNAs的靶基因中含有与心脏发育密切相关的关键基因(HAND1、NKX2-4、TBX-1、 MAP2K4、GATA4、NOTCH1、ZFPM2等)。4.靶基因GO/Pathway分析及筛选microRNA靶序列SNPs基因本体(Gene Ontology, GO)分析对靶基因进行功能注释,显示先心病差异表达microRNA调控的靶基因涉及多方面的功能,其中富集度(Fold Enrichment)最高的生物学过程相关功能条目为心脏右心室形态发生(cardiac right ventricle morphogenesis),相关靶基因为NOTCH1、HAND1、ZFPM2、GATA3,调控这4个靶基因的nicroRNA为let-7e-5p、miR-222-3p和 miR-433,在先心病患者血浆中表达均下调(P0.05)。KEGG pathway分析获得靶基因与差异microRNAs的显著性调控通路(P0.05),多数通路与心脏发育、肿瘤发生、出生缺陷、以及新生儿生长发育或心血管疾病有关,关注与MAPK通路有关的心脏发育重要的转录因子GATA4。对靶基因通过显著性功能分析,构建microRNA与靶基因的调控网络。筛选出3个核心基因(NOTCH1/GATA3/GATA4)靶序列的11个功能性SNPs及23个可能参与调控的microRNA,作为研究先心病人群易感性关联及其发生机制的参考。5.GATA4基因3’UTR靶位点SNPs与CHDs易感性关联选择GATA4基因lnicroRNA靶序列中的8个位点SNPs进行基因型检测对比分析。有6个位点(rs867858A C、rs884662TC、rs904018TC、rs12825 C G、rs12458AT、和rs3203358C G)的等位基因或基因型分布频率差异存在统计学意义(P0.05),与先心病易感性有关联。rs867858A C位点中,C等位基因的OR为1.498(95%CI:1.209-1.857), A/C和C/C基因型分别是A/A基因型患病风险的1.428倍(OR=1.428,95%CI:1.028-1.982)和2.496倍(OR=2.496,95%C7: 1.553-0.672); rs884662TC位点中,C等位基因的OR为2.124(95%C7: 1.615-2.794), T/C和C/C基因型分别是T/T基因型患病风险的1.70倍(OR=1.70,95%CI:1.200-2.409)和4.628倍(OR=4.628,95%CI:2.273-9.423); rs904018TC位点中,C等位基因的OR为0.481(95%CI：0.387-0.599),T/C和C/C基因型者分别是T/T基因型患病风险的0.529倍(95%CI:0.338-0.827)和0.261倍(95%CI：0.166-0.412)；rs12825 CG位点中,G等位基因的OR为0.770(95%CI：0.620-0.956), C/G和G/G基因型与CHDs的发生风险可能无关(OR=0.950,95%CI：0.605-1.492, P=0.824)、(OR=0.645,95%CI:0.406-1.025, P=0.062); rs12458AT位点中,T等位基因的OR为0.679(95%CI：0.549-0.840),A/T和T/T基因型分别是AA基因型患病风险的0.612倍(95%CI：0.396-0.939)和0.423倍(95%CI：0.266-0.672)；rs3203358CG位点中,G等位基因的OR为0.673(95%CI：0.527-0.860),C/G和G/G基因型分别是C/C基因型患病风险的0.699倍(95%CI：0.508-0.962)和0.469倍(95%CI:0.257-0.854)。各标签SNPs与先心病不同临床类型的关联强度有一些差异,总的关联模式与总类结果比较一致。6.连锁不平衡分析以及单倍型分析遗传标记位点间的连锁不平衡分析结果表明,rs12458-rs12825-rs867858之间存在紧密连锁(D’为0.81～0.94)、rs904018-rs3203358之间也存在紧密连锁(D’为0.95)。Haploview软件分析显示,rs867858、rs904018和rs884662位点为标签SNPs (Tag SNPs)。这3个标签SNPs(排列顺序为rs867858、rs884662、rs904018)的单倍型分析显示,ATC单倍型(OR=0.581,95%CI：0.567-0.986)和CCT单倍型(OR=3.698,95%CI:2.500-5.471)在CHDs组与对照组间的频率具有统计学差异。其中,ATC单倍型为保护性单倍型,CCT单倍型是CHDs的风险性单倍型。7.SNPs rs3203358影响miR-583对GATA4的表达调控通过构建SNPs rs3203358C/G不同基因型GATA4-3' UTR表达载体,采用荧光素酶报告基因的方法研究发现,miR-583可以显著降低野生型C等位基因的荧光素酶活性,而对突变型G等位基因的荧光素酶活性没有影响。该多态由CG的变化,逃逸了niR-583对GATA4的负调控,使基因相对高表达。结论1.通过microRNA表达谱芯片筛选及两阶段扩大样本的qRT-PCR验证,得到了5种血浆差异表达的microRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433和miR-487b)可作为室间隔缺损诊断标志物。构建microRNA多指标Logisit ic回归分析模型,ROC曲线分析显示,3种血浆microRNA(miR-let-7e、2miR-155-5p、 miR-222-3 P)联合诊断模型的价值近似于5种nicroRNA的联合,可显著提高先心病的诊断效率,并具有临床应用的可行性。2.生物信息学分析预测得出差异表达microRNAs与先心病发生相关的靶基因,以及靶基因中可能参与调控的多条信号通路。microRNAs可能通过与多个靶基因的调控网络来影响心脏发育和先心病的形成。筛选出的3个核心基因(NOTCH1/GATA3/GATA4)靶序列的11个功能性SNPs可能会影响23种microRNA对靶基因的结合和表达调控,可作为深入研究的分子标志物参考。3.GATA4基因6个microRNA靶位点多态性与CHDs有关联。rs867858位点A/C、C/C基因型、C等位基因以及rs884662位点T/C、C/C基因型、C等位基因可能会增加CHDs发病风险；rs904018位点/C、C/C基因型、C等位基因,rs12458位点A/T、T/T基因型、T等位基因,rs3203358位点C/G. G/G基因型、G等位基因,rs12825 G等位基因可能会降低CHDs发病风险。3个标签SNPs综合分析表明,ATC单倍型为保护性单倍型,CCT单倍型为风险性单倍型。4.成功构建和鉴定携带目的基因片段的pMIR-GATA4的重组质粒,并通过荧光素酶报告基因实验初步验证了GATA4基因3' UTR rs3203358 (1521 CG)可能是miR-583的靶位点,miR-583可能通过该多态位点的结合来调控GATA4基因的表达水平,进而影响先心病的易感性。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.4

【参考文献】

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1 张程;钟诗龙;张智伟;;先天性心脏病继发性肺动脉高压患者血浆中miRNA的研究[J];岭南心血管病杂志;2014年04期

2 余章斌;韩树萍;朱春;董小s

本文编号：2773731