油桐KAR基因的克隆与功能研究
发布时间：2020-08-11 21:00
【摘要】：油桐是中国所特有的经济林木,同时也是世界上著名的工业用油树种,还被称为我国四大木本油料树种之一。桐油的脂肪酸主要由桐酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等组成,其中桐酸的含量最高,达70%以上,是一种优质的工业使用油。在油桐种子脂肪酸生物合成代谢的过程中,包括一系列调控生理生化代谢过程的酶和基因,其中包含最主要的FAS和FAE两个复合酶系统。本研究是以油桐‘葡萄桐’品种不同发育时期种子为材料,在已构建的转录组数据库的基础上,对FAS中油桐KAR基因进行全长cDNA克隆和功能研究,从而对油桐脂肪酸生物合成途径和油桐及油料树种的遗传改良提供科学依据。主要研究结果如下：1、油桐KAR基因的克隆及生物信息学分析。以油桐‘葡萄桐’品种成熟种子为材料,采用普通PCR扩增技术克隆获得油桐β-酮脂酰-ACP还原酶KAR基因家族的两个成员,并将其分别命名为Vf_KAR1和Vf_KAR2 (GenBank登录号：KF025646, KF025647)。Vf_KAR1和Vf_KAR2的ORF长度分别为993bp和903bp,所编码的蛋白质分子量分别为35kD和32kD,等电点分别为9.28和9.11,综合Vf_KAR1和Vf_KAR2的脂肪系数与总平均亲水性来分析可推测两基因编码的蛋白都为疏水性蛋白。KAR氨基酸Vf_KAR1存在1个跨膜域和1个疑似跨膜域,Vf_KAR存在2个疑似跨膜域。Vf_KAR1和Vf_KAR2都含有叶绿体转运肽和多个活性位点、NAD(P)结合位点,Vf_KAR1蛋白序列的90aa-256aa和Vf_KAR2蛋白序的59aa～225aa都是短链脱氢还原酶蛋白的保守区域,属于短链脱氢酶还原酶(SDR)家庭成员。Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白的二、三级构分析发现它们主要以α螺旋和β折叠为主,它们的结构中心由两个右手螺旋的βaβaβmotif组成。Vf_KAR1和Vf_KAR1氨基酸序列与其他物种的同源性在62～82%之间,Vf_KAR1和Vf_KAR1相似性仅有74%。综合以上生物信息学分析可推断Vf_KAR1和Vf_KAR1确为油桐KAR基因家族的两个成员。2、油桐KAR基因在油桐不同组织和不同发育时期的表达存在差异。利用标准曲线优化的体系进行qRT-PCR,检测Vf_KAR1和Vf_KAR2在不同组织和不同发育时期种子的表达模式。Vf_KAR1和Vf_KAR2在油桐12个不同组织中都有表达,这结果与其他植物相同,但Vf_KAR1主要是在种仁中表达,Vf_KAR2主要在茎和叶片中表达,这可能与Vf_KAR1和Vf_KAR2发挥的作用有关。Vf_KAR1基因在油桐种子9个不同发育时期的表达规律与油桐种子内油脂合成成正相关,在种子发育到7月的表达量较低,但到种子发育的8月初至9月初则具有较高的表达量,10月后由于种子逐近成熟,油脂合成代谢开始减弱,Vf_KAR1的表达量也开始减少,由此可知Vf_KAR1基因参与油桐种子油脂生物合成,并发挥着重要作用,而Vf_KAR1在种子整个发育时的表达量都较低且没有多大差异。3、油桐KAR蛋白亚细胞定位于烟草叶片叶绿体中。根据农杆菌侵染烟草叶瞬时表达进行亚细胞定位分析,发现Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白都定位于烟草叶片叶绿体中,这些结果与生物信息学预测结果相一致,这可能与Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白序列中存在叶绿体转运肽有关系。4、油桐KAR家族Vf_KAR2和Vf_KAR1蛋白之间的互作关系分析。采用Gateway技术,构建了pDEST32-Vf_KAR1、pDEST22-Vf_KAR1、pDEST32-Vf_KAR1、pDEST22-Vf_KAR2酵母表达载体并将诱饵质粒和猎物质粒成功的共转化到Mav203酵母中,确定了pDEST32-Vf_KAR1×pDEST22-Vf_KAR2 和 pDEST32-Vf_KAR2×pDEST22-Vf_KAR1双质粒的二倍体酵母细胞生长的3AT浓度为25mM, pDEST32-Vf_KAR1×pDEST22和pDEST32-Vf_KAR2×pDEST22双质粒的二倍体酵母细胞生长的3AT浓度为20mM。通过观察双质粒的二倍体酵母细胞生长在三缺培养基SC-Leu-Try-Ura和X-gal显色反应分析,Vf_KAR1和Vf_KAR2蛋白之间没有互作关系。
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S794.3
【图文】：
只是每一种憸基均ＬＪ憸基－ＣｏＡ的形式参加，内质网中合成过程中延逡逑长的憸基碳链由ＣｏＡ携带及中链或长链憸基－ＣｏＡ代替乙憸－ＣｏＡ参与反应Ｐｓ’Ｍｌ，逡逑其具体的超长链脂肪酸生物合成途径见图１．２。逡逑Ｉ邋ＣｎＩ逡逑Ｉ丙二度单巧ＣＯＡ逡逑逦逦＞￣｜邋ＣｎＢｓ邋联邋ＣｏＡ逦＼逡逑内质网逡逑Ｉ邋口－巧月旨巧ＣｏＡ—Ｉ逦Ｃ＾ＡＤＰＨ＾逦Ｉ目－巧腊病ｃ0Ａ￣｜逡逑、逦■￣￣Ｉ邋ｅ邋－居巧ｃ0＾￣ｈ＾逡逑图１．２超长链脂肪酸生物合成途径逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｖｅｉｙ邋ｌｏｎｇ邋ｃｈａｉｎ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑８逡逑
邋ｙ逡逑筋酶一＾逡逑图１．１植物短链和中长链脂肪酸的生物合成代谢逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｐｌａｎｔ邋ｓｈｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｌｏｎｇ邋ｃｈａｉｎ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏ巧Ｍｈｅｓｉｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑１．２．２．２植物超长链脂肪酸的合成代谢逡逑植物超长链脂肪酸的合成系统主要是在内质网中完成，Ｗ丙二酸单憸－ＣｏＡ逡逑为二碳单元供体，在脂肪酸延伸酶（Ｆａｔｔｙ邋Ａｃｉｄ邋Ｅｌｏｎｇａｓｅ，ＦＡＥ）复合体的催化作用下逡逑将碳１８脂肪酸的延伸为碳２０或者更长碳链的脂肪酸ｔｗ’ｉｅｉｎＦＡＥ属于膜绑定多酶逡逑复合体，它主要由４种酶组成，分别是（３－丽醋憸－ＣｏＡ合酶（（３－ｋｅｔｏａ巧１－ＣｏＡ巧ｎｔｈａｓｅ，逡逑ＫＣＳ）［７１］、（３－丽脂憸邋ＣｏＡ邋还原酶（Ｐ－ｋｅｔｏａ巧Ｉ－Ｃ０Ａ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，邋ＫＣＲ）［７２］，邋ｐ－哲憸－ＣｏＡ逡逑脱水酶（Ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡｄｅｈｙ邋ｄｒａｔａｓｅ，邋ＨＣＤ）ｔ７３ｌ邋和赌脂憸邋ＣｏＡ邋还原酶逡逑（Ｔｒａｎｓ－２，３－ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＥＣＲ）Ｐ４１。超长链脂肪酸的生物合成过程主要有四逡逑个反应
经在多种细茵、植物和顶口原虫等多种生物中发现了扮？基因的存在。他们属于逡逑短链脱氨酶还原酶（ＳＤＲ）的酶家族，家族有一个特别保守的ａ／ｐ折叠，折叠与逡逑折叠中存在Ｒｏｓｓｍａｎ形式ｔＷ。根据比较分析Ｅｃｏ／ｚ？洰？（图１．３Ａ巧日公ｍｓｊｋａ逡逑ｎｆｌb6Ｊc浫纾福矗常ㄍ迹保福┑牡ヌ褰峁狗⑾置扛龅ヌ逵桑犯觯姓鄣停父觯崧菪模义辖峁怪幸灿闪礁鲇沂郑校幔穑峄颍ǎ恚铮簦椋妫┳槌桑桓鲇桑穑椋穑埠停穑冲澹准埃幔欤澹幔插义献槌桑硪桓鍪怯桑穑矗澹穑岛停穑队耄ǎ矗澹幔底槌桑幔陈菪颜饬礁龌蛄釉谝诲义掀稹＃幔叮澹幔沸纬梢桓鎏厥獾幕颍虢峁怪幸病＃幔赣耄埃叮澹校妨樱鞍渍鄣义现罩褂冢幔浮；罨幸踩澹ǎ樱澹颍裕颍蹋螅┚奂谝黄穑挥谠冢校担幔担返母浇义希裕颍欤担焙停蹋螅欤担捣植荚冢幔德菪希樱澹颍欤常肝挥冢校岛停幔敌纬傻幕飞稀ｅ义希瑰义
本文编号：2789564
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S794.3
【图文】：
只是每一种憸基均ＬＪ憸基－ＣｏＡ的形式参加，内质网中合成过程中延逡逑长的憸基碳链由ＣｏＡ携带及中链或长链憸基－ＣｏＡ代替乙憸－ＣｏＡ参与反应Ｐｓ’Ｍｌ，逡逑其具体的超长链脂肪酸生物合成途径见图１．２。逡逑Ｉ邋ＣｎＩ逡逑Ｉ丙二度单巧ＣＯＡ逡逑逦逦＞￣｜邋ＣｎＢｓ邋联邋ＣｏＡ逦＼逡逑内质网逡逑Ｉ邋口－巧月旨巧ＣｏＡ—Ｉ逦Ｃ＾ＡＤＰＨ＾逦Ｉ目－巧腊病ｃ0Ａ￣｜逡逑、逦■￣￣Ｉ邋ｅ邋－居巧ｃ0＾￣ｈ＾逡逑图１．２超长链脂肪酸生物合成途径逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｖｅｉｙ邋ｌｏｎｇ邋ｃｈａｉｎ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑８逡逑
邋ｙ逡逑筋酶一＾逡逑图１．１植物短链和中长链脂肪酸的生物合成代谢逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｐｌａｎｔ邋ｓｈｏｒｔ邋ａｎｄ邋ｌｏｎｇ邋ｃｈａｉｎ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏ巧Ｍｈｅｓｉｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逡逑１．２．２．２植物超长链脂肪酸的合成代谢逡逑植物超长链脂肪酸的合成系统主要是在内质网中完成，Ｗ丙二酸单憸－ＣｏＡ逡逑为二碳单元供体，在脂肪酸延伸酶（Ｆａｔｔｙ邋Ａｃｉｄ邋Ｅｌｏｎｇａｓｅ，ＦＡＥ）复合体的催化作用下逡逑将碳１８脂肪酸的延伸为碳２０或者更长碳链的脂肪酸ｔｗ’ｉｅｉｎＦＡＥ属于膜绑定多酶逡逑复合体，它主要由４种酶组成，分别是（３－丽醋憸－ＣｏＡ合酶（（３－ｋｅｔｏａ巧１－ＣｏＡ巧ｎｔｈａｓｅ，逡逑ＫＣＳ）［７１］、（３－丽脂憸邋ＣｏＡ邋还原酶（Ｐ－ｋｅｔｏａ巧Ｉ－Ｃ０Ａ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，邋ＫＣＲ）［７２］，邋ｐ－哲憸－ＣｏＡ逡逑脱水酶（Ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ－ＣｏＡｄｅｈｙ邋ｄｒａｔａｓｅ，邋ＨＣＤ）ｔ７３ｌ邋和赌脂憸邋ＣｏＡ邋还原酶逡逑（Ｔｒａｎｓ－２，３－ｅｎｏｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＥＣＲ）Ｐ４１。超长链脂肪酸的生物合成过程主要有四逡逑个反应
经在多种细茵、植物和顶口原虫等多种生物中发现了扮？基因的存在。他们属于逡逑短链脱氨酶还原酶（ＳＤＲ）的酶家族，家族有一个特别保守的ａ／ｐ折叠，折叠与逡逑折叠中存在Ｒｏｓｓｍａｎ形式ｔＷ。根据比较分析Ｅｃｏ／ｚ？洰？（图１．３Ａ巧日公ｍｓｊｋａ逡逑ｎｆｌb6Ｊc浫纾福矗常ㄍ迹保福┑牡ヌ褰峁狗⑾置扛龅ヌ逵桑犯觯姓鄣停父觯崧菪模义辖峁怪幸灿闪礁鲇沂郑校幔穑峄颍ǎ恚铮簦椋妫┳槌桑桓鲇桑穑椋穑埠停穑冲澹准埃幔欤澹幔插义献槌桑硪桓鍪怯桑穑矗澹穑岛停穑队耄ǎ矗澹幔底槌桑幔陈菪颜饬礁龌蛄釉谝诲义掀稹＃幔叮澹幔沸纬梢桓鎏厥獾幕颍虢峁怪幸病＃幔赣耄埃叮澹校妨樱鞍渍鄣义现罩褂冢幔浮；罨幸踩澹ǎ樱澹颍裕颍蹋螅┚奂谝黄穑挥谠冢校担幔担返母浇义希裕颍欤担焙停蹋螅欤担捣植荚冢幔德菪希樱澹颍欤常肝挥冢校岛停幔敌纬傻幕飞稀ｅ义希瑰义
本文编号：2789564
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/shengwushengchang/2789564.html
最近更新
教材专著
