【摘要】：棉花(Gossypium hirsutum)是世界性的重要经济作物,在我国国民经济中占有重要地位。棉纤维作为重要的天然纤维,是纺织工业的主要原材料,广泛应用于纺织、造纸、生物燃料和化学工业,棉纤维品质决定了其作为商品的价值。然而,棉花经常受到诸如虫害等生物胁迫以及高盐、干旱、低温、营养缺乏等非生物胁迫,造成棉花产量急剧下降。因此,通过基因工程手段将一些具有抗逆功能的基因导入到植物基因组中获得抗逆新品种,将扩大植物对环境的适应性,降低逆境对作物的影响。 WRKY蛋白家族是植物特有的转录因子,因其含有60个氨基酸组成的WRKY结构域而得名。该类蛋白在N端含有保守的氨基酸基序WRKYGQK,在C端含有一个新型的C2H2或C2HC锌指基序。已有研究表明,WRKY转录因子在植物许多生理过程中发挥非常重要的作用,这些生理过程包括植物衰老、生长发育、生物和非生物胁迫(高温、高盐、干旱等)应答等。另外,植物某些器官的发育以及细胞内物质代谢,也受到WRKY蛋白的调控。但对于WRKY转录因子是否参与调控棉纤维发育,目前尚无报道。因此,研究阐明WRKY转录因子在棉花防御应答中的调控机理,以及WRKY转录因子在棉纤维发育中的作用,将是今后的一个重要研究方向。同时,上述研究对于培育抗逆作物品种也具有重要的实践意义。 我们首先对棉花cDNA文库中随机挑取的4000多个cDNA克隆进行测序,筛选获得4个WRKY基因(GhWRKY31-34),定量RT-PCR分析结果表明,这4个WRKY基因均在棉花根和叶片中优势表达。为获得在棉纤维发育中特异或优势表达的WRKY基因,我们通过电子克隆的方法得到22个WRKY基因。定量RT-PCR:分析结果表明,其中有2个基因(GhWRKY12/16)在棉纤维中优势表达。本文主要从基因结构特征分类和表达模式,以及蛋白结构特征、转录自激活活性和亚细胞定位等方面浅析GhWRKY基因的特性及功能表达调控等,此外也对它们在一些非生物胁迫应答中的作用进行了初步研究。获得的主要结果如下： 1、26个GhWRKY基因分离鉴定及其编码蛋白的序列结构特征 我们首先对棉花cDNA文库中随机挑取的4000多个cDNA克隆进行测序,筛选获得4个全长序列的WRKY基因(cDNA),命名为GhWRKY31, GhWRKY32, GhWRKY33和GhWRKY34,我们进一步在棉花公共EST资料库中筛查相关的WRKY cDNA序列,通过电子克隆的方法,获得另外22个GhWRKY基因(cDNA).这26个基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)分别为495bp-1302bp,编码蛋白长度为165-434个氨基酸。这些WRKY:蛋白的氨基酸序列中均含有WRKY结构域(WRKYGQK基序),C端具有典型的锌指序列结构C2H2或C2HC。 根据GhWRKY蛋白所含有的WRKY结构域的数量和锌指序列结构类型,可将这26个GhWRKY蛋白分为三大类,其中有5个蛋白归属于Ⅰ类,5个归属Ⅲ类,其他16个归属于Ⅱ类。根据Ⅱ类所含有的氨基酸不同,又可将其细分为Ⅱa，Ⅱb,Ⅱc,Ⅱd和Ⅱe五个亚类。 2、Gh WRKY基因在棉花中的表达分析 为研究所分离的26个WRKY基因在棉花中的表达谱,我们提取棉花不同组织的总RNA,逆转录为cDNA,以其为模板,进行荧光定量RT-PCR分析。结果表明,大多数Gh WRKY基因均在营养组织中优势表达,尤其是在根、叶、子叶和下胚轴组织中表达量相对较高。有2个基因(GhWRKY12/16)在开花后3-10天的棉纤维中优势表达,表明这些基因可能在起始和伸长期的棉纤维细胞中发挥一定的调控作用。 已有研究报道表明WRKY在非生物胁迫中发挥着重要作用。为研究所分离的26个WRKY基因是否也受非生物胁迫诱导,我们将在1/2MS上生长7天的棉花幼苗分别移至含有150mM NaCl,250mM甘露醇,100μM ABA的1/2MS液体培养基中处理5h,然后提取其总RNA,逆转录为cDNA,进行荧光定量RT-PCR分析。结果表明,在棉花根中,GhWRKY4/20/24/33/34在三种胁迫处理下其转录水平得到显著升高,GhWRKY/1O的表达水平受ABA和甘露醇的诱导,GhWRKYll/13NaCl和甘露醇两种胁迫处理中,其表达量均大幅度提高。此外,GhWRKY12/15/16/21/30/32只受NaCl的诱导,GhWRKY17/29只受甘露醇的诱导,GhWRKY19/23只受ABA的诱导；在棉花子叶中,58%的GhWRKY基因在三种胁迫处理下,其表达量均受到上调；在棉花下胚轴中,仅有GhWRKY11的表达量在三种胁迫处理下得到上调,GhWRKY11/13/16/20/24/26/29/30/33/34在ABA和NaCl处理下均上调其表达量,GHWRKY12/31/32仅在NaCl处理下,其表达量才得到上调。综上结果表明,在棉花生长发育中,GhWRKY基因对非生物胁迫响应的调节发挥着重要作用。 3、GhWRKY31/34蛋白亚细胞定位分析 构建了由CaMV35S启动子驱动的GhWRKY基因与绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因融合表达载体,通过农杆菌介导的DNA转移,利用浸花法转化拟南芥,获得GhWRKY31-GFP和GhWRKY34-GFP转基因植株,用转基因植株T2代进行表型分析。将T2代种子在MS培养基上萌发,待小苗生长5天后,在共聚焦显微镜下观察转基因拟南芥小苗根细胞的GFP荧光信号,结果表明GFP荧光信号主要积聚在细胞核内。上述结果证明GhWRKY31/34蛋白定位于细胞核。 4、GhWRKY蛋白转录自激活分析 为研究GhWRKY蛋白是否具有转录自激活活性,构建了6个基因(Gh WRKY12/16/31/32/33/34)(?)的酵母表达载体(pGBKT7-GhWRKY12/16/31/32/33/34),分别转化酵母菌株AH109和Y187,将转AH109的阳性单菌落分别在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His平板上划线培养,同时对转Y187阳性单菌落进行X-Gal滤纸显色分析。结果表明GhWRKY31/33蛋白具有转录自激活效应,GhWRKY12/16/32/34不具有转录自激活效应。 5、过量表达Gh WRKY专基因拟南芥植株的抗盐性分析 构建了过量表达GhWRKY12/31/34载体,通过浸花法转入拟南芥,获得这3个WRKY基因的转基因拟南芥植株。通过多代(T1-T3代)分析表明,正常生长条件下,过量表达GhWRKY12、GhWRKY31和GhWRKY34的转基因拟南芥植株生长发育正常,与野生型植株相同。通过qRT-PCR分析表明,在棉花中GhWRKYl2/31/34基因表达都受到盐胁迫诱导,因而推测这3个基因可能参与了植物盐胁迫应答过程。因此,我们分别用100、150和200mMNaCl处理转基因植株,统计种子萌发率和幼苗绿叶率、根长,测定幼苗叶片叶绿素含量以及盐胁迫相关基因的表达变化等指标。结果表明,与野生型相比较,GhWRKY12/34转基因拟南芥植株耐盐性增强,而GhWRKY31转基因拟南芥植株在种子萌发期对盐胁迫的耐受性有所提高,但在幼苗生长期对盐胁迫敏感。 6、GhWRKY转基因棉花 构建了GhWRKY12/16过量表达和RNA干扰(RNAi)载体,通过农杆菌介导的DNA转移,转化棉花下胚轴外植体,获得愈伤组织。经过7-8个月的继代培养,诱导产生胚性愈伤组织,进而分化出胚状体,胚状体萌发生长成小植株。到目前为止,已获得大量胚性愈伤组织,其中部分胚性愈伤组织分化出苗,已获得30多株转基因棉花小苗,移栽到土中生长发育。进一步的实验正在进行中。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S562
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本文编号：2794816
