双孢菇子实体生长发育与采后衰老过程中乙烯的调控及其生物合成途径的探究
发布时间：2020-10-11 23:40
乙烯作为结构最简单的植物激素,在植物的生长发育、果蔬的成熟衰老、抗逆反应等过程中扮演着重要的角色。其在高等植物中的生理作用、生物合成和分子作用机理已经得到了系统深入的研究。食用菌具有高营养和药用价值,受到消费者的喜爱。然而,相比较高等植物,食用菌中乙烯的产生及作用研究极少。本研究以食用菌中模式材料双孢菇(Agaricus bisporus Lange Sing)为试材,探讨乙烯对子实体生长发育与采后衰老的影响、乙烯合成途径及调控规律,为解决食用菌采后衰老难题提供理论参考。主要研究结果如下： 采用气相色谱法检测双孢菇子实体不同生长发育和采后贮藏时期乙烯释放量变化。结果表明,各个时期子实体均能产生乙烯,但生长发育期产量极低,而在采后贮藏期,乙烯产量随着子实体继续发育和衰老逐渐增加,分别在子实体刚破膜开伞和释放孢子初期产生高峰,产量分别为贮藏前的83和209倍,说明乙烯可能参与子实体采后的衰老过程。 采用0.05%乙烯利处理采收时期子实体,研究其对子实体内源乙烯和衰老的影响。结果表明,采后乙烯利处理加速了内源乙烯释放高峰的到来,增加了子实体的开伞率和开伞度,加大了子实体细胞膜渗透率和膜脂过氧化程度,加快了可溶性蛋白、可溶性总糖的降解,同时抑制了子实体抗氧化相关酶活和物质的增加。由此说明,乙烯能够加速子实体采后的衰老。 采用高等植物乙烯合成前体物质L-MET(甲硫氨酸)、SAM(S-腺苷甲硫氨酸)和ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)处理采收时期子实体,发现乙烯释放高峰均提前出现,并且乙烯产量有了不同程度的增加,而高等植物关键酶ACS (ACC合酶)抑制剂AOA(氨基氧乙酸)、ACO (ACC氧化酶)抑制剂CoCl2和叠氮钠处理显著抑制了乙烯释放量。此外,不仅从子实体中检测到了ACS和ACO活性、及ACC含量,而且克隆得到了与高等植物中同源的多个乙烯合成元件。我们认为,双孢菇中至少存在一种途径与高等植物中乙烯合成途径相似,即Met→SAM→ACC→乙烯。另外,子实体膨大和采后贮藏时期,ACO酶活的跃变幅度均大于ACS,且乙烯利处理诱导ACO酶活的上升先于ACS酶活的上升,说明ACO可能在双孢菇乙烯合成途径中发挥重要的调控作用。 利用实时定量PCR和Western杂交检测了双孢菇中乙烯合成相关元件的表达规律。结果表明,子实体生长发育阶段低水平的乙烯合成主要受AbACS2基因的调控,其他5个基因的表达水平均很低；然而,采后贮藏中乙烯的合成受AbACS1、AbACS2和AbACO三个基因的协调控制,且呈现转录水平的时间表达差异性；此外,采后乙烯利处理诱导贮藏中AbACO基因表达的上升先于AbACS1和AbACS2,且在诱导程度上远大于AbACSl和AbACS2,具有诱导表达差异性；ACO蛋白随着子实体采后衰老逐渐累积,在菌褶组织表达最高,具有组织表达差异性。以上说明,双孢菇中乙烯合成具有类似高等植物的转录水平和蛋白水平的调控。 将双孢菇AbACO进行序列分析、同源建模、定点突变和动力学研究,结果表明,活性中心处第289位氨基酸残基的不同是导致AbACO与高等植物ACOs底物结合特性不同的主要原因。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：S646;TS219
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
第一章 立题依据与文献综述
1.1 课题的研究意义
1.2 国内外研究现状分析
1.2.1 双孢菇采后生理生化研究进展
1.2.2 乙烯与果蔬的成熟衰老研究进展
1.2.3 不同进化程度生物中乙烯合成途径研究进展
1.3 研究目标和研究内容
1.3.1 研究目标
1.3.2 研究内容
第二章 双孢菇子实体中乙烯产生的规律及采后乙烯利处理对其衰老的影响
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.2 处理方法
2.2.3 主要化学试剂
2.2.4 主要实验仪器
2.2.5 实验方法
2.3 结果与分析
2.3.1 生长发育阶段双孢菇子实体中乙烯释放的规律
2.3.2 双孢菇采后贮藏时期子实体中乙烯释放的规律
2.3.3 采后乙烯利处理对双孢菇子实体贮藏期间衰老的影响
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 双孢菇子实体中乙烯生物合成途径的探究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 处理方法
3.2.3 主要化学试剂及配置方法
3.2.4 主要实验仪器
3.2.5 实验方法
3.3 结果与分析
3.3.1 基于三种已知乙烯生物合成途径初步明确双孢菇子实体中的乙烯合成途径
3.3.2 双孢菇子实体生长发育阶段和采后贮藏中ACS和ACO活性、ACC含量的变化规律
3.3.3 采后乙烯利处理对双孢菇子实体贮藏期间ACS和ACO活性、ACC含量的影响
3.3.4 高等植物中乙烯合成关键酶抑制剂处理对双孢菇子实体贮藏期间ACS和ACO活性的影响
3.3.5 双孢菇子实体中乙烯合成的类高等植物ACC途径相关基因的克隆
3.4 讨论
3.5 结论
第四章 双孢菇子实体中乙烯合成类ACC途径相关元件的转录和蛋白水平调控
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 处理方法
4.2.3 载体
4.2.4 主要化学试剂
4.2.5 主要溶液配制
4.2.6 主要实验仪器
4.2.7 实验方法
4.3 结果与分析
4.3.1 双孢菇子实体中乙烯合成的类ACC途径在转录水平的调控
4.3.2 双孢菇子实体中ACO蛋白的组织、时间和诱导表达模式
4.4 讨论
4.5 结论
第五章 双孢菇子实体中ACO蛋白的功能鉴定和活性位点分析
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 表达载体
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要溶液配制
5.2.5 主要实验仪器
5.2.6 实验方法
5.3 结果与分析
5.3.1 重组AbACO蛋白的制备
5.3.2 AbACO氨基酸序列与植物中ACOs氨基酸序列的比对
5.3.3 AbACO蛋白的结构模拟及定点突变
2+的亲和性'> 5.3.5 光谱分析确定AbACO蛋白对Fe2+的亲和性
2+的亲和性'> 5.3.6 光谱分析确定AbACO蛋白对Co2+的亲和性
5.4 讨论
5.5 结论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢
个人简介
【参考文献】
本文编号：2837296
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：S646;TS219
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词
第一章 立题依据与文献综述
1.1 课题的研究意义
1.2 国内外研究现状分析
1.2.1 双孢菇采后生理生化研究进展
1.2.2 乙烯与果蔬的成熟衰老研究进展
1.2.3 不同进化程度生物中乙烯合成途径研究进展
1.3 研究目标和研究内容
1.3.1 研究目标
1.3.2 研究内容
第二章 双孢菇子实体中乙烯产生的规律及采后乙烯利处理对其衰老的影响
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.2 处理方法
2.2.3 主要化学试剂
2.2.4 主要实验仪器
2.2.5 实验方法
2.3 结果与分析
2.3.1 生长发育阶段双孢菇子实体中乙烯释放的规律
2.3.2 双孢菇采后贮藏时期子实体中乙烯释放的规律
2.3.3 采后乙烯利处理对双孢菇子实体贮藏期间衰老的影响
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 双孢菇子实体中乙烯生物合成途径的探究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 处理方法
3.2.3 主要化学试剂及配置方法
3.2.4 主要实验仪器
3.2.5 实验方法
3.3 结果与分析
3.3.1 基于三种已知乙烯生物合成途径初步明确双孢菇子实体中的乙烯合成途径
3.3.2 双孢菇子实体生长发育阶段和采后贮藏中ACS和ACO活性、ACC含量的变化规律
3.3.3 采后乙烯利处理对双孢菇子实体贮藏期间ACS和ACO活性、ACC含量的影响
3.3.4 高等植物中乙烯合成关键酶抑制剂处理对双孢菇子实体贮藏期间ACS和ACO活性的影响
3.3.5 双孢菇子实体中乙烯合成的类高等植物ACC途径相关基因的克隆
3.4 讨论
3.5 结论
第四章 双孢菇子实体中乙烯合成类ACC途径相关元件的转录和蛋白水平调控
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 处理方法
4.2.3 载体
4.2.4 主要化学试剂
4.2.5 主要溶液配制
4.2.6 主要实验仪器
4.2.7 实验方法
4.3 结果与分析
4.3.1 双孢菇子实体中乙烯合成的类ACC途径在转录水平的调控
4.3.2 双孢菇子实体中ACO蛋白的组织、时间和诱导表达模式
4.4 讨论
4.5 结论
第五章 双孢菇子实体中ACO蛋白的功能鉴定和活性位点分析
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 表达载体
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要溶液配制
5.2.5 主要实验仪器
5.2.6 实验方法
5.3 结果与分析
5.3.1 重组AbACO蛋白的制备
5.3.2 AbACO氨基酸序列与植物中ACOs氨基酸序列的比对
5.3.3 AbACO蛋白的结构模拟及定点突变
2+的亲和性'> 5.3.5 光谱分析确定AbACO蛋白对Fe2+的亲和性
2+的亲和性'> 5.3.6 光谱分析确定AbACO蛋白对Co2+的亲和性
5.4 讨论
5.5 结论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
致谢
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本文编号：2837296
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