葡萄SnRK2基因家族的全基因组鉴定、表达分析及VvSnRK2.2基因的功能验证

发布时间：2017-04-06 16:08

  本文关键词：葡萄SnRK2基因家族的全基因组鉴定、表达分析及VvSnRK2.2基因的功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：葡萄(Vitis vinifera L.)是葡萄科葡萄属落叶藤本植物,是世界上广泛栽培的重要经济果树之一。随着社会的发展和人口的增多,环境日益恶化。干旱、盐渍化、高温、低温以及氧化胁迫等都严重影响植物的生长和发育,进而影响果树的产量和品质,因而提高植物的抗逆性成为当前农业研究的主要目标之一。SnRK2(蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2；Sucrose non-fermenting1-related protein kinases2),是植物体所特有的一类丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。研究表明,SnRK2家族成员在植物的生长和发育过程中起着重要的作用,包括细胞分化、植物代谢、细胞内的信号转录以及对干旱、极端温度和盐渍化等非生物胁迫的响应等。本论文的主要研究内容包括以下三个方面：1、运用生物信息学的方法,从全基因组水平上鉴定葡萄SnRK2家族成员基因,并对其系统发生、理化性质、二级结构、基因结构、motif、C末端序列和EST等方面进行预测和分析；2、利用基因芯片数据和荧光定量RT-PCR对葡萄SnRK2家族基因在组织/器官发育及不同生物/非生物胁迫处理条件下的表达模式进行了分析；3、在5BB中克隆了VvSnRK2.2基因,成功构建了过量表达载体,并利用花粉管通道法转化拟南芥,以进一步了解其功能。主要结果如下： 1.利用隐马可夫模型(HMM)搜索和系统建树的方法,在葡萄中共鉴定出了6个VvSnRK2基因,并对其进行了理化性质、二级结构、基因结构、motif、C末端和EST等的预测和分析。结果表明,葡萄VvSnRK2家族为亲水性蛋白,二级结构主要以a-螺旋和不规则卷曲为主；在系谱发生上葡萄VvSnRK2s蛋白分为3个亚族；基因结构分析表明,葡萄中6个基因的外显子和内含子的分布非常保守,所有基因都含有9个外显子,并且除了VvSnRK2.3基因的内含子插入位点为1相位之外,所有基因内含子的插入位点都为O相位；motif和C末端序列分析表明,葡萄SnRK2基因家族具有较高的保守性；EST分析表明,6个基因在10个组织中呈不均匀分布,其中主要分布在果实、细胞悬浮物、叶片和花中。 2.利用芯片数据分析了葡萄中6个SnRK2基因在组织/器官发育及生物/非生物胁迫处理条件下的表达模式。组织发育芯片数据表明,VvSnRK2s参与种子发育及果实的发育和衰老,并受到生物和非生物胁迫的诱导。在种子发育中,VvSnRK2.1.VvSnRK2.2和VvSnRK2.3主要表现为上调表达,VvSnRK2.5为下调表达。在果实发育和衰老过程中,多数VvSnRK2基因都表现为下调表达,且以VvSnRK2.5下调表达最为显著；在生物/非生物胁迫芯片数据分析中,VvSnRK2.6受白粉病和高温的诱导,而VvSnRK2.1受水分胁迫和盐的诱导；ABA的芯片数据分析结果与文献报道相一致,即第一亚家族不受ABA的诱导,第二亚家族受ABA的微弱诱导,第三亚家族受ABA的强烈诱导。 3.为了进一步了解葡萄中6个SnRK2(VvSnRK2.1-VvSnRK2.6)基因的表达模式及功能,我们利用荧光定量RT-PCR的方法分析了这6个基因在ABA、干旱、NaCl、高温(45℃)和低温(4℃)等处理条件下的表达情况。结果表明,VvSnRK2.1在干旱和NaCl处理后显著上调表达,与芯片数据相一致；VvSnRK2.2和VvSnRK2.4受到高温的诱导；VvSnRK2.3受低温的诱导；VvSnRK2.1和VvSnRK2.5受ABA的显著诱导。 4.为了进一步验证葡萄VvSnRK2家族基因的功能,我们从葡萄砧木5BB中克隆了VvSnRK2.2基因,构建了植物双元表达载体(35S:VvSnRK2.2),转化农杆菌,并利用花粉管通道法转化拟南芥,初步GUS染色获得了6个抗性株系,利用RT-PCR对2株抗性株系L34和L42进行了检测。以转基因拟南芥T3代种子和幼苗为材料,对转基因拟南芥进行了非生物胁迫抗性分析,结果表明,在ABA (10μM和50μM)处理培养基上,L34和L42转基因株系比野生型(WT)的反应更加敏感,且在对照(CK)和各种处理培养基上转基因拟南芥的叶片生长正常,而野生型(WT)叶片在ABA培养基上生长6天后表现为上翘(或向上卷曲),初步推测,该基因可能与气孔的运动或叶片组织结构有关系；通过植物抗旱性分析,证明VvSnRK2.2能够提高拟南芥对干旱的抗性,而在NaCl处理条件下,转基因株系比对照更加敏感。
【关键词】：葡萄 VvSnRK2 生物信息学分析 RT-PCR 遗传转化
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S663.1
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 缩略语12-13
• 引言13-14
• 第一章 文献综述14-34
• 1 蛋白激酶14-19
• 1.1 蛋白激酶的分类14
• 1.2 植物蛋白激酶研究进展14-19
• 1.2.1 受体蛋白激酶(RLK)15-16
• 1.2.2 分裂原激活蛋白激酶(MAPK)16-17
• 1.2.3 钙依赖而钙调素不依赖蛋白激酶(CDPK)17
• 1.2.4 蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶(SnRK)17-19
• 2 S RK2蛋白激酶家族结构19-20
• 3 S RK2蛋白激酶的活性及表达20-21
• 4 SnRK2蛋白激酶家族的调控网络21-23
• 5 本研究的目的和意义23-25
• 参考文献25-34
• 第二章 葡萄SnRK2基因家族的全基因组鉴定和生物信息学分析34-48
• 摘要34-35
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 数据库的搜索35-36
• 1.2 序列分析和系统进化树的构建36
• 1.3 S RK2蛋白质结构分析36
• 1.4 SnRK2基因结构分析36
• 1.5 SnRK2 C-末端motif分析36
• 1.6 SnRK2 C-末端序列比对分析36-37
• 1.7 SnRK2的EST分析37
• 2 结果与分析37-44
• 2.1 葡萄SnRK2候选基因的确定和染色体的定位37-38
• 2.2 葡萄SnRK2蛋白质理化性质分析38
• 2.3 葡萄SnRK2蛋白二级结构分析38
• 2.4 葡萄SnRK2的系谱发生38-41
• 2.5 葡萄SnRK2的基因结构分析41-42
• 2.6 葡萄SnRK2的C末端motif分析42-43
• 2.7 葡萄SnRK2 C-末端序列比对分析43
• 2.8 葡萄SnRK2的EST表达分析43-44
• 3 讨论44-46
• 参考文献46-48
• 第三章 葡萄SnRK2家族基因的表达分析48-72
• 摘要48-49
• 1 材料和方法49-53
• 1.1 芯片数据49
• 1.2 材料和处理49-50
• 1.3 引物50-51
• 1.4 试剂和仪器51
• 1.5 方法51-53
• 1.5.1 总RNA的提取51
• 1.5.2 总RNA中DNA的消化及cDNA第一链的合成51-52
• 1.5.3 荧光定量PCR分析52-53
• 2 结果与分析53-61
• 2.1 葡萄SnRK2基于芯片数据的表达分析53-56
• 2.1.1 葡萄SnRK2基因在不同组织、器官及其不同发育阶段的表达情况53-55
• 2.1.2 葡萄SnRK2响应生物和非生物胁迫的表达情况55-56
• 2.1.3 葡萄SnRK2响应外源ABA的表达情况56
• 2.2 葡萄SnRK2基于荧光定量PCR(qRT-PCR)的表达分析56-61
• 2.2.1 处理材料RNA的提取56-57
• 2.2.2 葡萄SnRK2基因荧光引物筛选57-58
• 2.2.3 干旱处理条件下葡萄中6个SnRK2基因的表达情况58
• 2.2.4 NaCl处理条件下葡萄中6个SnRK2基因的表达情况58
• 2.2.5 高温处理条件下葡萄6个SnRK2基因的表达情况58-59
• 2.2.6 低温处理条件下葡萄中6个VvSnRK2基因的表达情况59
• 2.2.7 ABA处理条件下葡萄中6个SnRK2基因的表达情况59-61
• 3 讨论61-62
• 参考文献62-72
• 第四章 葡萄VvSnRK2.2的克隆、序列分析及拟南芥遗传转化72-88
• 摘要72-73
• 1 材料和方法73-79
• 1.1 材料73-74
• 1.1.1 植物材料73
• 1.1.2 仪器、试剂和耗材73
• 1.1.3 载体质粒和农杆菌菌株73-74
• 1.2 方法74-79
• 1.2.1 基因克隆74-77
• 1.2.2 载体构建77-78
• 1.2.3 拟南芥遗传转化(花粉管通道法)78-79
• 2 结果与分析79-86
• 2.1 基因的克隆与序列分析79-83
• 2.1.1 总RNA的提取79-80
• 2.1.2 VvSnRK2.2基因的克隆80
• 2.1.3 VvSnRK2.2基因的序列分析80-83
• 2.2 植物表达载体的构建83-84
• 2.2.1 带酶切位点的VvSnRK2.2基因的克隆83
• 2.2.2 载体构建成功农杆菌菌液检测83-84
• 2.3 拟南芥转基因株系的检测84-86
• 2.3.1 TO代转基因种子的初步筛选84
• 2.3.2 转基因拟南芥GUS染色结果84-85
• 2.3.3 转基因株系T3代GUS染色85
• 2.3.4 RT-PCR检测85-86
• 3 讨论86-87
• 参考文献87-88
• 第五章 VvSnRK2.2基因的功能验证88-98
• 摘要88-89
• 1 材料和方法89-90
• 1.1 材料89
• 1.1.1 植物材料89
• 1.1.2 仪器和试剂89
• 1.2 方法89-90
• 1.2.1 转基因株系在正常生长条件下的表型观察89
• 1.2.2 转基因株系在各种胁迫处理条件下的表型观察89-90
• 2 结果与分析90-96
• 2.1 野生型拟南芥和转基因株系的发芽状态90
• 2.2 野生型拟南芥和转基因株系的初生根长度90-91
• 2.3 野生型拟南芥和转基因株系非生物胁迫抗性分析91-96
• 2.3.1 野生型拟南芥和转基因拟南芥在对照培养基上的生长情况91
• 2.3.2 NaCl(100mM)处理条件下的表型观察91-92
• 2.3.3 ABA(1OμM和50μM)处理条件下的表型观察92-94
• 2.3.4 转基因株系抗旱性分析94-96
• 3 讨论96-97
• 参考文献97-98
• 全文结论98-100
• 主要创新点100-102
• 附录102-106
• 攻读硕士学位期间所发表论文106-108
• 致谢108

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李琳;柳参奎;;SnRK蛋白激酶家族及其成员SnRK2的功能[J];分子植物育种;2010年03期

2 朱先灿;胡鸢雷;谭之京;祝建波;林忠平;;非豆科植物共生受体样蛋白激酶研究进展[J];生物工程学报;2007年03期

3 周庆红,李成琼,匡全;植物蛋白激酶研究进展[J];生物学杂志;2003年03期

4 郁松林,黄卫东;高温胁迫下葡萄叶片蛋白激酶的诱导形成与活性变化[J];植物生理与分子生物学学报;2004年03期

5 ;W55a Encodes a Novel Protein Kinase That Is Involved in Multiple Stress Responses[J];Journal of Integrative Plant Biology;2009年01期

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本文编号：289183