全氟化合物PFOA、PFOS内分泌干扰效应的研究

发布时间：2017-04-09 04:18

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【摘要】：全氟化合物（PFCs）是一类具有重要应用价值的有机化合物，因其具有优良的稳定性、表面活性、疏水疏脂等特性，被广泛应用于工业和民用领域。PFCs广泛分布在各种环境介质和生物体内，且具有难降解性和生物蓄积性，是一种新型持久性有机污染物（POPs）。近年来，PFCs对生态环境和人体健康带来的不利影响受到全球的普遍关注，成为环境科学和毒理学领域的研究热点。 研究表明，PFCs能造成机体的内分泌系统发生紊乱，已成为环境内分泌干扰效应物（EDCs）筛检的重点。全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）是两种典型的PFCs，目前尚没有对其内分泌干扰活性的完整研究。国际上EDCs筛选程序中推荐采用体内（in vivo）和体外（in vitro）试验的组合测试法。本项目采用代表性PFCs（PFOA、PFOS）作为研究对象，通过体外成组方法筛选受试物的拟/抗雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）、甲状腺激素受体（TR）活性、过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）活性及对类固醇激素合成的影响，利用模式生物斑马鱼、SD大鼠，在体内水平研究PFOA、PFOS对机体内分泌系统的影响及作用机制，综合评价PFCs的内分泌干扰效应。 第一部分 体外试验筛选PFOA、PFOS的内分泌干扰活性 第一节PFOA、PFOS对激素受体的干扰活性 目的 环境化合物可以通过受体介导途径发挥内分泌干扰效应，采用受体介导的报告基因试验体系，检测和评价PFOA、PFOS对雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）、甲状腺激素受体（TR）、过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）激动或拮抗作用。 方法 通过瞬时转染，将激素受体（ER、TR、PPAR）表达质粒、含有相应激素反应元件的荧光素酶（Luc）报告基因质粒，转染到激素受体阴性的CV-1细胞中，建立ER、TR、PPAR介导的报告基因试验方法，用来检测PFOA、PFOS的拟/抗雌激素、甲状腺激素、过氧化物酶体增殖剂激活受体活性；利用稳定转染雄激素反应原件报告基因的MDA-Kb2细胞来检测PFOA、PFOS的拟/抗雄激素活性。 结果 在ER介导的报告基因试验中，FPOA、PFOS单独作用，不能显著诱导报告基因Luc的表达；与1×10-9M E2共同作用，在受试浓度3×10-9-3×10-7M内可协同E2增强报告基因Luc的表达。在AR介导的报告基因试验中，未发现PFOA、PFOS对Luc有明显的诱导和抑制作用。在TR介导的报告基因试验中，PFOA（1×10-8-3×10-7M）、PFOS（1×10-7M、3×10-7M）能抑制5×10-9M T3诱导的Luc表达量。在PPAR介导的报告基因试验中，PFOA、PFOS在受试范围内表现出PPAR激动作用。 结论 PFOA、PFOS具有雌激素协同活性、抗甲状腺激素活性、PPAR激动活性。 第二节PFOA、PFOS对类固醇激素合成的影响 目的 环境化合物可以通过非受体介导途径来发挥内分泌干扰效应，通过研究PFOA、PFOS对类固醇激素合成过程的影响，来评价它们的类固醇激素合成干扰效应。 方法 采用人肾上腺皮质瘤细胞H295R，检测PFOA、PFOS作用后对H295R细胞中类固醇激素（雌二醇和睾酮，即E2和T）水平、类固醇激素合成过程中关键酶基因及关键调控因子（SF-1）表达的影响。 结果 PFOA在1×10-8M及更高浓度时，增加细胞内E2的水平，在3×10-8M及以上，抑制T的水平。PFOS在3×10-8M及以上，增加E2的表达，在1×10-7M和3×10-7M浓度时，降低T的表达。PFOA、PFOS可以不同程度的改变类固醇合成过程中关键酶基因的表达。在10种与类固醇激素合成相关的基因中，PFOA作用后显著上调17βHSD1、3βHSD2、CYP11B2、CYP19的表达，下调CYP17、17βHSD4、CYP11A的表达。PFOS暴露后显著上调HMGR、StAR、CYP11A、CYP19、3βHSD2、CYP11B2的表达，下调CYP17、17βHSD1、CYP21的表达。PFOA暴露还可导致类固醇合成关键调控因子SF-1的基因和蛋白表达水平降低。 结论 PFOA、PFOS可以影响H295R细胞中类固醇激素的合成过程，具有类固醇激素合成干扰效应。 第二部分 体内试验研究PFOA、PFOS的内分泌干扰效应 第一节PFOA、PFOS对斑马鱼胚胎发育的影响 目的 利用模式生物斑马鱼，研究PFOA、PFOS短期暴露对斑马鱼胚胎发育、内分泌相关基因以及整体基因表达的影响。 方法 受精后4h（4hpf）的斑马鱼胚胎，用100、200、500μg/L的PFOA、PFOS染毒至120hpf。观察斑马鱼胚胎/幼鱼的生长状况，包括胚胎死亡、孵化、生长发育、有无胚胎发育畸形等情况。检测120hpf的斑马鱼幼鱼体内内分泌相关基因（包括雌激素受体表达基因esr1、esr2b，甲状腺早期分化关键基因hhex、pax8，类固醇激素合成基因cyp19a、cyp19b、cyp17）的表达情况。在此基础上，进行单一浓度多暴露终点的斑马鱼胚胎暴露试验。选择500μg/L的PFOA、PFOS在斑马鱼4hpf-120hpf期间染毒，染毒至12hpf、24hpf、48hpf、72hpf、96hpf、120hpf，观察各时间点的胚胎发育情况，选取暴露至120hpf的斑马鱼幼鱼，利用斑马鱼表达谱芯片检测整体基因的表达情况，分析筛选出关键差异表达基因。 结果 在4hpf-120hpf染毒期间，受试浓度下的PFOA、PFOS对斑马鱼胚胎/幼鱼的生长发育没有产生明显影响，但可引起斑马鱼幼鱼内分泌相关基因的表达发生改变。与对照组相比，500μg/L的PFOA引起esr1基因水平的上调，对esr2b的表达无影响；200μg/L、500μg/L的PFOA能显著增加hhex、pax8的表达量；PFOA对类固醇合成酶相关基因的影响不大。在最高浓度下，PFOS暴露使esr1的表达量增加、esr2b的表达量降低；PFOS浓度依赖性的增加hhex和pax8的表达；200μg/L、500μg/L的PFOS暴露能显著抑制cyp19a、cyp19b、cyp17的表达。120hpf的斑马鱼表达谱芯片结果提示，多个通路上的多种基因在PFOS暴露后发生改变，差异表达基因主要参与到细胞过程、代谢过程、生物调控、发育等生物学过程。 结论 PFOA、PFOS暴露可对斑马鱼的基因表达产生影响，发挥潜在的干扰效应。 第二节PFOA、PFOS对大鼠青春期发育的影响 目的 环境化合物暴露与青春期启动时间的异常密切相关。流行病学研究发现PFOA、PFOS的暴露和青春期启动的改变有关，但对其干扰青春期发育的相关机制一直未得到阐明。我们采用雌性大鼠模型，研究PFOA、PFOS在关键时间段暴露对雌性青春期启动和发育的影响，并探究其相关机制。 方法 采用SD雌性大鼠，在新生期（出生后1-5天，PND1-5）和青春前期（出生后26-30天，PND26-30）两个暴露阶段分别进行不同剂量的PFOA、PFOS（0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg）染毒。测定大鼠出生时、PND15、PND25、PND35、阴道开口日的体重和肛门-生殖器距离（AGD），记录雌鼠进入青春期的年龄（阴道开口时间）、首次发情期时间、雌性周期，检测血清雌激素和促黄体生成素（LH）的水平，计算卵巢系数，进行卵巢组织病理分析和卵泡计数。采用Q-RT-PCR分析下丘脑Kisspeptin/GPR54系统中Kiss1、Kiss1r、ERα、ERβ基因表达的变化，采用免疫组织化学方法检测kisspeptin蛋白表达水平，，以探讨该系统在PFOA、PFOS所致的青春期启动时间改变中发挥的作用。选择染毒雌鼠的肝脏组织，测定肝脏系数，进行肝脏功能相关血生化指标的检测，采用GC-MS进行血清脂肪酸组、肝脏代谢组测定，以探讨PFOA、PFOS在发育关键期短期暴露对肝脏功能的影响。 结果 新生期、青春前期10mg/kg PFOA、1mg/kg和10mg/kg PFOS短期暴露，可引起雌鼠阴道开口时间比对照组早4-5天，提前进入青春期。新生期PFOA、PFOS暴露后，以非剂量依赖性的方式增加雌鼠体重和AGD；青春前期暴露也可增加雌鼠PND35的体重。在两个暴露阶段处理后，低、中剂量的PFOA、PFOS染毒组大鼠都能出现不规律的雌性周期，表现为延长的静止期或发情后期。PND1-5和PND26-30暴露于PFOA、PFOS的雌鼠血清雌激素和LH水平上升，新生期对激素的影响强于青春前期。化合物染毒未引起卵巢组织结构发生明显改变，但可影响卵泡数量，在新生期低剂量的PFOA、PFOS组大鼠可见生长卵泡数量减少。下丘脑前腹侧室周核（AVPV）和弓状核（ARC）区域Kiss1、Kiss1r、ERα的基因水平下降，免疫组化结果显示kisspeptin纤维密度在PFOA、PFOS的高剂量暴露组受到抑制，与基因表达的结果趋势大体相同。对于大鼠肝脏，高剂量组的PFOA、PFOS可以增加肝脏重量。GC-MS分析结果显示，血清中多种脂肪酸的含量发生改变，肝脏代谢小分子分析显示，PFOA、PFOS导致的差异表达物质主要集中在代谢通路、半乳糖代谢通路、脂肪酸合成通路等。 结论 新生期、青春前期短期暴露于环境剂量下的PFOA、PFOS能够影响下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的调控，导致雌性青春期启动的提前，其中kisspeptin/GPR54系统在其中起了关键作用。新生期暴露于PFOA、PFOS也可影响体内脂肪酸代
【关键词】：报告基因 ER AR TR PPAR H295R类固醇合成试验 类固醇激素 激素合成关键基因 SF-1 斑马鱼胚胎短期暴露试验 斑马鱼表达谱芯片 青春期 阴道开口 Kisspeptin/GPR54 肝脏 代谢
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要5-11
• Abstract11-19
• 序言19-24
• 第一部分 体外试验筛选 PFOA、PFOS 的内分泌干扰活性24-56
• 第一节 PFOA、PFOS 对激素受体的干扰活性24-38
• 前言24-25
• 材料与方法25-30
• 结果30-35
• 讨论35-38
• 第二节 PFOA、PFOS 对类固醇激素合成的影响38-56
• 前言38-39
• 材料与方法39-49
• 结果49-53
• 讨论53-56
• 第二部分 体内试验研究 PFOA、PFOS 的内分泌干扰效应56-120
• 第一节 PFOA、PFOS 对斑马鱼胚胎发育的影响56-77
• 前言56-57
• 材料与方法57-62
• 结果62-74
• 讨论74-77
• 第二节 PFOA、PFOS 对大鼠青春期发育的影响77-120
• 前言77-79
• 材料与方法79-89
• 结果89-113
• 讨论113-120
• 主要创新点120-121
• 参考文献121-135
• 综述135-177
• 参考文献168-177
• 附录177-183
• 致谢183-184

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本文编号：294454