柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的鉴定和表达模式研究

发布时间：2021-03-06 02:21

　　柑橘全爪螨Panonychus citri （McGregor）是我国柑橘产区的第一大害螨,其大量发生严重影响柑橘的产量和品质,且以化学防治为主的控制措施加之该螨自身的特点（繁殖速度快、体小、活动范围小等）,导致其抗性问题日益凸显。目前,对于相橘全爪螨解毒代谢及抗药性机理的报道相对较少,且多集中在生化水平及有限基因的鉴定方面。细胞色素P450酶系作为昆虫（螨）体内一类关键解毒酶系,可代谢多种内源和外源化合物,在昆虫（螨）对杀虫（螨）剂解毒代谢过程中起着十分重要的作用。诸多研究表明,蜱螨P450与拟除虫菊酯类、有机磷类、METIs、季酮酸类、生物源类等多种杀螨剂抗性有关。国内外有关细胞色素P450酶系的研究多针对P450的特性展开,而对于酶系发挥作用的关键因子NADPH-细胞色素P450还原酶（CRP）和细胞色素b5（CYB5）的作用地位涉及相对较少。因此,对细胞色素P450酶系进行整体研究,将有利于全面理解细胞色素P450酶及其相关基因在解毒代谢过程中的作用方式和具体定位,从而为全面解析其解毒代谢及介导的代谢抗性机制奠定理论基础。本学位论文以柑橘全爪螨为研究对象,围绕细胞色素P450对... 

【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：294 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 柑橘全爪螨的为害现状及抗性问题
    2 昆虫（螨）抗性机制的研究
    3 细胞色素P450酶系
    4 转录组学在昆虫（螨）抗药性研究中的应用
    5 昆虫杆状病毒表达系统在P450功能研究中的应用
前言
    1 论文的研究背景及意义
    2 论文的研究思路与总体框架
第二章 柑橘全爪螨抗药性监测及主要解毒酶活性比较
    第一节 柑橘全爪螨四个种群田间抗药性测定
        1 材料与方法
            1.1 供试螨源
            1.2 供试主要试剂和仪器
            1.3 生物测定
            1.4 数据分析
        2 结果与分析
        3 小结
    第二节 柑橘全爪螨主要解毒酶活性比较
        1 材料与方法
            1.1 供试螨源
            1.2 供试主要试剂和仪器
            1.3 不同发育阶段螨源的收集
            1.4 不同种群螨源的收集
            1.5 柑橘全爪螨的药剂胁迫和诱导
            1.6 主要解毒酶活性测定
            1.7 数据分析
        2 结果与分析
            2.1 柑橘全爪螨P450s活性分析
            2.2 柑橘全爪螨GSTs活性分析
            2.3 柑橘全爪螨CarEs活性分析
        3 小结
    本章讨论
        1 田间种群抗性监测
        2 主要解毒酶活性研究
第三章 柑橘全爪螨转录组数据库建立和解毒酶基因的筛选鉴定
    1 材料与方法
        1.1 供试螨源
        1.2 供试主要试剂（盒）和仪器
        1.3 柑橘全爪螨总RNA的提取
        1.4 柑橘全爪螨转录组测序及数据分析
        1.5 解毒酶基因鉴定及通路分析
    2 结果与分析
        2.1 柑橘全爪螨总RNA的提取质量
        2.2 柑橘全爪螨转录组测序情况分析
        2.3 功能注释
        2.4 柑橘全爪螨解毒酶基因鉴定及通路分析
    3 小结
    本章讨论
第四章 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的克隆与序列分析
    第一节 基于转录组数据的柑橘全爪螨P450基因cDNA的克隆及序列分析
        1 材料与方法
            1.1 供试螨源
            1.2 供试主要试剂（盒）和仪器
            1.3 总RNA提取
            1.4 第一链cDNA的合成
            1.5 引物设计
            1.6 PCR扩增
            1.7 柑橘全爪螨P450基因序列及系统发育分析
        2 结果与分析
            2.1 柑橘全爪螨P450基因cDNA全长的获得
            2.2 柑橘全爪螨P450基因cDNA序列的生物信息学分析
            2.3 柑橘全爪螨P450基因同源性分析
            2.4 柑橘全爪螨P450基因系统发育分析
        3 小结
5基因cDNA的克隆及序列分析">    第二节 柑橘全爪螨细胞色素P450还原酶和细胞色素b₅基因cDNA的克隆及序列分析
        1 材料与方法
            1.1 供试螨源
            1.2 供试主要试剂（盒）和仪器
            1.3 总RNA提取
            1.4 第一链cDNA的合成
            1.5 引物设计
            1.6 PCR扩增、产物克隆及测序
            1.7 柑橘全爪螨CPR和CYB5基因序列及系统发育分析
        2 结果与分析
            2.1 柑橘全爪螨CPR和CYB5基因cDNA序列分析
            2.2 柑橘全爪螨CPR和CYB5基因系统发育分析
        3 小结
    本章讨论
        1 细胞色素P450的集团分类及同源结构分析
5的分子生物学特性">        2 细胞色素P450还原酶和细胞色素b₅的分子生物学特性
            2.1 细胞色素P450还原酶
5">            2.2 细胞色素b5

第五章 柑橘全爪螨细胞色素P450及其相关基因的表达模式研究
    第一节 柑橘全爪螨P450基因的表达模式解析
        1 材料与方法
            1.1 供试螨源
            1.2 供试主要试剂（盒）和仪器
            1.3 不同发育阶段螨源的收集
            1.4 药剂胁迫和诱导
            1.5 总RNA提取
            1.6 第一链cDNA合成
            1.7 引物设计及内参基因选择
            1.8 引物熔解曲线及扩增效率分析
            1.9 定量PCR
            1.10 数据分析
        2 结果与分析
            2.1 扩增产物熔解曲线及引物扩增效率
            2.2 柑橘全爪螨不同发育阶段P450基因的表达模式
            2.3 柑橘全爪螨P450基因对药剂胁迫的响应表达模式
            2.4 柑橘全爪螨P450基因对巴比妥酸钠诱导响应的表达模式
        3 小结
    第二节 柑橘全爪螨CPR和CYB5基因的表达模式解析
        1 材料与方法
            1.1 供试螨源
            1.2 供试主要试剂（盒）和仪器
            1.3 不同发育阶段螨源的收集
            1.4 柑橘全爪螨的药剂胁迫和诱导
            1.5 总RNA提取和第一链cDNA合成
            1.6 引物设计及内参基因选择
            1.7 引物熔解曲线及扩增效率分析
            1.8 定量PCR
            1.9 数据分析
        2 结果与分析
            2.1 扩增产物熔解曲线及引物扩增效率
            2.2 柑橘全爪螨不同发育阶段PcCPR和PcCYB5基因的表达模式
            2.3 柑橘全爪螨PcCPR和PcCYB5基因对药剂胁迫响应的表达模式
            2.4 柑橘全爪螨PcCPR和PcCYB5基因对巴比妥酸钠诱导响应的表达模式
        3 小结
    本章讨论
        1 细胞色素P450基因的表达模式
5基因的表达模式">        2 细胞色素P450还原酶和细胞色素b₅基因的表达模式
            2.1 细胞色素P450还原酶
5">            2.2 细胞色素b₅

第六章 柑橘全爪螨细胞色素P450基因的真核表达
    1 材料与方法
        1.1 供试主要试剂盒和仪器
        1.2 细胞培养
        1.3 PCR扩增及pMD-19T Simple载体构建
        1.4 表达载体构建
        1.5 细胞转染及病毒株获取
        1.6 P450重组蛋白表达及含量测定
    2 结果与分析
        2.1 柑橘全爪螨P450基因与pMD-19T Simple重组载体构建
        2.2 pFastBac-CYP392A24和pFastBac-CYP392F1重组质粒的构建
        2.3 Bacmid-CYP392A24和Bacmid-CYP392F1重组杆粒的构建
        2.4 重组杆粒对昆虫细胞的转染
        2.5 CYP392A24和CYP392F1重组蛋白的表达及含量测定
    3 小结
    本章讨论
第七章 主要结论、创新点及研究展望
    1 主要结论
        1.1 明确了重庆地区柑橘全爪螨对主要药剂的抗性水平
        1.2 掌握了主要解毒酶系在柑橘全爪螨不同螨态和不同药剂下的活性变化情况
        1.3 构建了柑橘全爪螨全螨态转录组数据库
        1.4 筛选鉴定出了柑橘全爪螨主要解毒酶基因和代谢通路信息
        1.5 克隆获得了柑橘全爪螨11个P450基因及CPR和CYB5基因
        1.6 解析了P450及CPR、CYB5基因在不同螨态的表达模式
        1.7 明确了P450及CPR、CYB5基因对不同药剂胁迫及诱导的响应模式
        1.8 初步构建了柑橘全爪螨P450的真核表达体系
    2 创新点
    3 展望
参考文献
在读期间发表论文目录及参研课题情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]基于新一代测序技术的昆虫转录组学研究进展[J]. 张棋麟,袁明龙.  昆虫学报. 2013(12)
[2]几种代谢酶基因与柑橘全爪螨对双甲脒抗性的关系[J]. 陈飞,张云飞,刘浩强,李鸿筠,冉春.  植物保护学报. 2013(02)
[3]柑橘全爪螨两个田间种群抗性监测及羧酸酯酶生化特性研究[J]. 张昆,丁天波,杨爵铭,豆威,王进军.  应用昆虫学报. 2013(02)
[4]橘全爪螨对双甲脒的抗性选育及其P450基因的表达差异分析[J]. 冉春,江高飞,刘斌,刘浩强,李鸿筠,王进军.  昆虫学报. 2012(06)
[5]柑橘全爪螨田间种群敏感性测定及三种主要解毒酶活性比较[J]. 丁天波,牛金志,夏文凯,孙倩倩,豆威,王进军.  应用昆虫学报. 2012(02)
[6]基于Solexa高通量测序的黄曲条跳甲转录组学研究[J]. 贺华良,宾淑英,吴仲真,林进添.  昆虫学报. 2012(01)
[7]德国小蠊谷胱甘肽S-转移酶在不同发育阶段活性变化及其在野外种群中的水平[J]. 李秋红,钱坤,周小洁,曾晓芃,高希武.  中国媒介生物学及控制杂志. 2011(05)
[8]二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性选育及解毒酶活力变化[J]. 高新菊,沈慧敏.  昆虫学报. 2011(01)
[9]柑橘全爪螨对4种杀螨剂的抗性监测及增效作用[J]. 刘永华,蒋红波,袁明龙,樊钰虎,杨丽红,陈静,王进军.  果树学报. 2010(04)
[10]桔全爪螨田间种群对杀螨剂的敏感性[J]. 冉春,陈洋,袁明龙,王进军,刘浩强,姚廷山.  植物保护学报. 2008(06)

博士论文
[1]桔小实蝇消化和解毒代谢相关基因鉴定及其对药剂胁迫的应激反应[D]. 申光茂.西南大学 2013
[2]桔小实蝇GSTs生化及分子毒理学特性研究[D]. 胡飞.西南大学 2012
[3]柑橘全爪螨Panonychus citri（McGregor）对热胁迫的响应机制研究[D]. 杨丽红.西南大学 2011
[4]桔全爪螨对甲氰菊酯和阿维菌素的抗性及其酯酶基因的克隆与表达研究[D]. 何恒果.西南大学 2010
[5]嗜卷书虱P450基因的分子生物学特性及其异源表达研究[D]. 蒋红波.西南大学 2010
[6]3种书虱酯酶基因的克隆及其mRNA表达水平研究[D]. 唐培安.西南大学 2009
[7]植物次生物质对棉铃虫细胞色素P450s的诱导及CYP6B6基因的克隆与表达[D]. 刘小宁.中国农业大学 2005
[8]小菜蛾抗阿维菌素品系细胞色素P450的研究[D]. 黄剑.西北农林科技大学 2005
[9]棉铃虫细胞色素P450的诱导、纯化及其性质研究[D]. 郑明奇.中国农业大学 2003

硕士论文
[1]棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰[D]. 汪丹.南京农业大学 2011
[2]家蚕和野桑蚕解毒酶活性的比较及野桑蚕CYP9A20V1基因的克隆与表达[D]. 徐生才.苏州大学 2009



本文编号：3066273

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