大体积样本神经元胞体快速成像方法与系统研究
发布时间：2021-06-01 07:13
对大脑进行研究进而获得脑功能的机理对神经疾病的治疗与人工智能的发展具有重大意义。为了理解大脑,一个基本需求是获取全脑范围内神经元胞体特异性分布信息。获取该信息主要包含两个步骤:全脑胞体成像数据的采集;与参考图谱配准、脑区分割、胞体计数。作为脑功能研究的重要基础之一,研究人员对快速、精确地获取神经元胞体分布的需求一直有增无减。针对这一目标,传统方法对大脑进行手工切片成像配准,耗时费力且会引入较大人工误差。新发展的显微光学切片断层成像技术能获取神经元精细结构,但长达数天的样本制备和成像较为耗时。光片成像技术在细胞分辨率下实现了快速全脑成像,但文献中与之相配的样本光透明处理需数天时间。同时,透明试剂还会导致样本变形,增加后期配准难度;对荧光的淬灭还会影响胞体统计。另外,现有全脑图像配准方法往往要借助背景通道信息来提高配准精度,存在数据量较大、数据分析时间长等问题。总结现有文献,现有方法无法实现一天内完成包括样本制备、全脑成像与数据分析完整流程。面对操作流程长,样本尺寸大、数量多等困难,如何高通量地获取神经元胞体分布信息,成为了脑科学研究中急需解决的一个重要问题。针对以上问题,本文系统性地研究...
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
MOST系列成像方法，分别为MOST、fMOST、2p-fMOST和WVT[66-69]
7华中科技大学博士学位论文图1.2STP成像方法[70,71]Fig.1.2STPimagingmethods[70,71]21世纪以来，光片显微成像技术由于光学层析和面扫描等特点，具有高信噪比和高轴向分辨率、低光漂白和毒性、高成像速度等优势，给生物成像领域带来了迅猛发展和深刻革命。2004年欧洲分子生物学实验室Huisken等人发展的选择性平面照明成像技术（SelectivePlaneIlluminationMicroscopy，SPIM）[72]被认为是现代光片技术的开端[48]。利用柱面镜将激发光压成片状来侧面照明样本，用物镜在垂直于照明平面方向上进行探测，在10帧的速度下首次展示了长时间成像发育胚胎的结果[48]。由于组织对光的散射和吸收，SPIM只能成像相对透明的样本（如斑马鱼胚胎）。后续Huisken等人在SPIM基础上发展了多角度选择性平面照明成像技术（MultidirectionalSelectivePlaneIlluminationMicroscopy，mSPIM），绕其照明焦点旋转实现更均匀的光片照明，减小组织光散射和吸收带来的误差[73]。生物组织对样本的散射和吸收阻碍了光片显微技术用于大样本成像。针对这一难点，2007年马克斯·普朗克精神病学研究所Dodt等人在SPIM基础上引入两天左右的样本光透明处理，采用了双边光片照明，命名为超级显微镜（Ultramicroscopy）[74]。这种双边照明方式减小了光照过程中遇到不透明结构时产生的条带阴影，提高了成像质量。虽然受限于物镜工作距离只能获得胞体分辨的成像结果，但是这种结合光透明的成像策略展示了光片成像技术用于大体积样本成像的潜力，极大地推动了光片成像技术在生物成像中的应用。后续工作中，研究人员针对光透明技术中样本透明程度、荧光标记保持效率等方面不断进行优化，发展了CUBIC、CLARITY以及uDISCO等光透明技术，结合光片成像系统通常可以在数小时内以胞体?
8华中科技大学博士学位论文图1.3光片照明成像方法，分别为SPIM和Ultramicroscopy[72,74]Fig.1.3Lightsheetilluminationimagingmethods,SPIMandUltramicroscopy,respectively[72,74]2008年华盛顿大学圣路易斯医学院Terrence等人发展了物镜耦合平面照明显微成像技术（Objective-CoupledPlanarIlluminationMicroscopy，OCPIM），将光片与样本表面成45°放置，在头固定活体小鼠脑组织中实现了100μm厚度功能钙信号的记录[79]。在本文工作开展同期时间，纽约冷泉港实验室Narasimhan等人发展了斜光片断层成像系统（ObliqueLightSheetTomography，OLST）[80]。引入10天样本光透明处理，用明胶包埋样本，单层成像250μm后切除已成像部分，循环进行下一层成像。在0.75×0.75×2.5μm的采样率下14小时成像完一个小鼠全脑。2017年武汉光电国家研究中心张等人采用40倍数值孔径0.8的物镜来进行斜光片照明和探测，结合树脂包埋与金刚石刀切削，在大体积样本上实现了高分辨特别是高轴向分辨的神经元结构获取[81,82]。同年，中国科技大学Wang等人发展了同步倾斜扫描和读出体成像系统（VolumetricImagingwithSynchronizedon-the-fly-oblique-scanandReadout，VISoR）[83]，样本首先被切成300μm厚的脑片进行光透明和折射率匹配处理，再按序列摆放进行斜光片扫描成像。在0.49×0.49×3.5μm的采样率下，2小时内完成小鼠全脑所有脑片的成像。以MOST为代表的断层成像系统在大体积范围内实现了神经元精细结构成像。2010年Science在第6005期刊发表专题评论，评价该技术创造出迄今为止最精细的小鼠全脑神经元三维连接图谱[84]。基于这种策略，如选用低倍物镜来降低成像分辨率
【参考文献】：
期刊论文
[1]Whereto the mega brain projects?[J]. Mu-ming Poo. National Science Review. 2014(01)
[2]脑网络:从脑结构到脑功能[J]. 蒋田仔,刘勇,李永辉. 生命科学. 2009(02)
[3]音圈电机的技术原理[J]. 张大卫,冯晓梅. 中北大学学报(自然科学版). 2006(03)
博士论文
[1]共聚焦荧光显微光学切片断层成像[D]. 齐晓莉.华中科技大学 2014
[2]双光子荧光显微光学切片断层成像方法与系统研究[D]. 郑廷.华中科技大学 2013
[3]适用于荧光蛋白标记大样本的塑性包埋方法研究[D]. 杨中琴.华中科技大学 2013
[4]用于绘制高分辨小鼠全脑图谱的断层成像系统研究[D]. 李安安.华中科技大学 2010
本文编号：3209919
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
MOST系列成像方法，分别为MOST、fMOST、2p-fMOST和WVT[66-69]
7华中科技大学博士学位论文图1.2STP成像方法[70,71]Fig.1.2STPimagingmethods[70,71]21世纪以来，光片显微成像技术由于光学层析和面扫描等特点，具有高信噪比和高轴向分辨率、低光漂白和毒性、高成像速度等优势，给生物成像领域带来了迅猛发展和深刻革命。2004年欧洲分子生物学实验室Huisken等人发展的选择性平面照明成像技术（SelectivePlaneIlluminationMicroscopy，SPIM）[72]被认为是现代光片技术的开端[48]。利用柱面镜将激发光压成片状来侧面照明样本，用物镜在垂直于照明平面方向上进行探测，在10帧的速度下首次展示了长时间成像发育胚胎的结果[48]。由于组织对光的散射和吸收，SPIM只能成像相对透明的样本（如斑马鱼胚胎）。后续Huisken等人在SPIM基础上发展了多角度选择性平面照明成像技术（MultidirectionalSelectivePlaneIlluminationMicroscopy，mSPIM），绕其照明焦点旋转实现更均匀的光片照明，减小组织光散射和吸收带来的误差[73]。生物组织对样本的散射和吸收阻碍了光片显微技术用于大样本成像。针对这一难点，2007年马克斯·普朗克精神病学研究所Dodt等人在SPIM基础上引入两天左右的样本光透明处理，采用了双边光片照明，命名为超级显微镜（Ultramicroscopy）[74]。这种双边照明方式减小了光照过程中遇到不透明结构时产生的条带阴影，提高了成像质量。虽然受限于物镜工作距离只能获得胞体分辨的成像结果，但是这种结合光透明的成像策略展示了光片成像技术用于大体积样本成像的潜力，极大地推动了光片成像技术在生物成像中的应用。后续工作中，研究人员针对光透明技术中样本透明程度、荧光标记保持效率等方面不断进行优化，发展了CUBIC、CLARITY以及uDISCO等光透明技术，结合光片成像系统通常可以在数小时内以胞体?
8华中科技大学博士学位论文图1.3光片照明成像方法，分别为SPIM和Ultramicroscopy[72,74]Fig.1.3Lightsheetilluminationimagingmethods,SPIMandUltramicroscopy,respectively[72,74]2008年华盛顿大学圣路易斯医学院Terrence等人发展了物镜耦合平面照明显微成像技术（Objective-CoupledPlanarIlluminationMicroscopy，OCPIM），将光片与样本表面成45°放置，在头固定活体小鼠脑组织中实现了100μm厚度功能钙信号的记录[79]。在本文工作开展同期时间，纽约冷泉港实验室Narasimhan等人发展了斜光片断层成像系统（ObliqueLightSheetTomography，OLST）[80]。引入10天样本光透明处理，用明胶包埋样本，单层成像250μm后切除已成像部分，循环进行下一层成像。在0.75×0.75×2.5μm的采样率下14小时成像完一个小鼠全脑。2017年武汉光电国家研究中心张等人采用40倍数值孔径0.8的物镜来进行斜光片照明和探测，结合树脂包埋与金刚石刀切削，在大体积样本上实现了高分辨特别是高轴向分辨的神经元结构获取[81,82]。同年，中国科技大学Wang等人发展了同步倾斜扫描和读出体成像系统（VolumetricImagingwithSynchronizedon-the-fly-oblique-scanandReadout，VISoR）[83]，样本首先被切成300μm厚的脑片进行光透明和折射率匹配处理，再按序列摆放进行斜光片扫描成像。在0.49×0.49×3.5μm的采样率下，2小时内完成小鼠全脑所有脑片的成像。以MOST为代表的断层成像系统在大体积范围内实现了神经元精细结构成像。2010年Science在第6005期刊发表专题评论，评价该技术创造出迄今为止最精细的小鼠全脑神经元三维连接图谱[84]。基于这种策略，如选用低倍物镜来降低成像分辨率
【参考文献】：
期刊论文
[1]Whereto the mega brain projects?[J]. Mu-ming Poo. National Science Review. 2014(01)
[2]脑网络:从脑结构到脑功能[J]. 蒋田仔,刘勇,李永辉. 生命科学. 2009(02)
[3]音圈电机的技术原理[J]. 张大卫,冯晓梅. 中北大学学报(自然科学版). 2006(03)
博士论文
[1]共聚焦荧光显微光学切片断层成像[D]. 齐晓莉.华中科技大学 2014
[2]双光子荧光显微光学切片断层成像方法与系统研究[D]. 郑廷.华中科技大学 2013
[3]适用于荧光蛋白标记大样本的塑性包埋方法研究[D]. 杨中琴.华中科技大学 2013
[4]用于绘制高分辨小鼠全脑图谱的断层成像系统研究[D]. 李安安.华中科技大学 2010
本文编号：3209919
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