西玛津对两栖类发育影响的分子生物学研究

发布时间:2017-05-30 11:09

  本文关键词:西玛津对两栖类发育影响的分子生物学研究,,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:西玛津(Simazine,2-Chloro-4,6-bis Ethylamino-1,3,5-Triazine)是一种在农业,园艺和休闲场所广泛应用的三嗪除草剂。该除草剂从1955被研发上市。西玛津能够通过化学、光催化或者生物过程进行降解。降解研究已经发现西玛津在土壤和水中的半衰期在几天和150天间变化。温度和湿度能够影响西玛津的半衰期,低温和干燥能够延长降解时间。2009年,美国环保总局鉴于西玛津的多重暴露途径和高生产量,将其列入内分泌干扰物筛选计划(EDSP)。在中国,西玛津也是一种在地下水和地表水中经常被检测到的除草剂。内分泌干扰物是指由能够干扰天然荷尔蒙的合成、分泌、运输、结合、活性的外源物质,从而导致有关体内平衡、生殖、发育和行为的异常。研究显示,西玛津属于内分泌干扰物(EDCs),在体外的抗雄激素筛选实验中西玛津表现出了刺激效应;在动物实验中,西玛津对多个物种的生长、发育、免疫和内分泌系统都产生了不利影响,包括对哺乳类和两栖类的生殖系统毒性。西玛津由于其在土壤和水中的高残留,在美国、欧洲和澳大利亚的地表水和地下水中是经常被检测到的第二类物质,在我国河流和出厂水中也时常被检测到。西玛津在地表水和地下水中的浓度因为会受到季节和被调查地区使用以西玛津为基本成分的除草剂的范围的影响,所以是可变的。在美国西玛津在地表水中的浓度可以高达1300 μg/L,在地下水中高达800 μg/L。根据WHO的水纯净标准,自来水中西玛津的浓度达到2μg/L时便被认为是污染水。所以,本研究将西玛津的浓度设为0.1、1、10和100 μg/L,该浓度梯度包括了从低到高多个西玛津的环境相关浓度,确保高浓度的西玛津能够对实验动物产生发育毒性,以便进一步的对其毒性作用机制进行研究。两栖类具有复杂的生活周期和渗透性的皮肤,能通过多路径暴露于陆地和水体中的环境污染物,这些特性使他们成为一种检测内分泌干扰物暴露和相关作用的理想的模式生物。同时,环境污染是导致近年来全球两栖类数量大量减少的主要原因。两栖类成为当今世界上生存形式最为严峻的群体。因此,为了保证两栖类的种群延续和生态健康,从多水平研究内分泌干扰物对两栖类生长发育的影响已成为必然。本论文的目的是在研究西玛津对中华大蟾蜍和非洲爪蟾的生长发育产生阳性有害影响的前提下,对其相关联的分子水平的改变进行研究。本研究分别以本地种两栖动物中华大蟾蜍和模式种两栖动物非洲爪蟾为动物模型,研究西玛津对这两个物种生长发育的影响、以及西玛津对非洲爪蟾的肝脏相关基因(vtga2、ar、er、gr、hsp70、hsp90)表达水平和雄性性腺组织的杂交微阵列芯片表达谱的影响。通过基因表达的性能分析来探索介导外源雌激素对非洲爪蟾不利影响的分子路径和细胞过程。初步推测西玛津对两栖类发育毒性的信号通路和作用机制,为在分子水平的进一步研究提供理论基础。中华大蟾蜍暴露西玛津的实验设0.01% DMSO对照组和4个西玛津染毒组(0.1、1、10和100 μg/L)。每个剂量组随机挑选发育到第25/26期的正常蝌蚪144只蝌蚪,平均放入8个25×20×20 cm3的平行缸中暴露85 d。在暴露期间,每天记录动物的生长发育情况、死亡数、变态情况;染毒结束后,进行性腺的组织病理学切片的制作和观察;对中华大蟾蜍的一般生长发育指标的数据进行统计处理。结果显示,10和100 μg/L西玛津导致中华大蟾蜍蝌蚪死亡率显著升高(p0.01,分别是对照组的2.17和2.86倍);西玛津对中华大蟾蜍的一般生长情况(体重、体长)无显著性影响(p0.05);在各时间点对非洲爪蟾蝌蚪前腿发生的百分比无显著性的抑制(p0.05),但10和100 μg/L西玛津使中华大蟾蜍蝌蚪后腿的伸展时间显著延长,与对照组相比分别延长了2.1%(p0.05)和6.9%(p0.01);西玛津抑制了中华大蟾蜍蝌蚪变态,各暴露组在实验结束时皆有少数处于38-40期的发育异常个体;西玛津导致中华大蟾蜍卵巢组织的卵细胞溶解、坏死,形成空泡,生殖细胞减少,睾丸组织中出现睾丸卵母细胞;西玛津暴露组中出现了发育显著迟缓无法辨认性别的性腺;暴露组的中华大蟾蜍性别比与对照组的相比未见显著差异(p0.05);西玛津暴露各组中均未见异常性腺形态。非洲爪蟾暴露西玛津的实验也设0.01% DMSO对照组和4个西玛津染毒组(0.1、1、10和100μg/L)。每个剂量组随机挑选发育至46/47阶段的健康蝌蚪120只,平均放入8个25×20×20 cm3的平行缸中暴露100 d。在暴露期间,每天记录动物的生长发育情况、死亡数和变态情况。染毒结束后,制作非洲爪蟾性腺和肝脏的组织病理学切片并镜下观察;对爪蟾的一般生长发育指标的数据进行统计处理;采用Q-RT-PCR对雌雄爪蟾肝脏相关基因表达量进行检测;在100 μg/L西玛津暴露组雄性非洲爪蟾的生殖系统生理学和毒理学终点具有显著性改变的基础上,采用非洲爪蟾全基因组芯片(Agilent Xenopus 4x44K Gene Expression Microarrays)对雄性非洲爪蟾性腺组织进行基因表达谱研究。根据差异基因的功能角色和FC值,从结果中选取15个关键基因,采用Q-RT-PCR方法对表达谱数据进行验证。然后,采用生物信息学技术GO分析和pathway分析对复杂的差异表达基因数据进行处理转换。寻求改变的生理学和毒理学终点与基因表达改变的关联性。西玛津对非洲爪蟾具有明显的发育毒性。10和100μg/L西玛津导致非洲爪蟾的死亡率皆比对照组显著升高64.3%(p0.05)。西玛津对非洲爪蟾的体重和体长没有影响(p0.05)。10和100μg/L西玛津使雄性非洲爪蟾的睾丸重量和GSI与对照组相比皆显著下降57.1%(p0.05)。雌性爪蟾的卵巢重量和GSI未受影响(p0.05);西玛津没有影响非洲爪蟾卵巢组织结构的发育,但对睾丸组织结构的影响显而易见。暴露各组的睾丸切片中出现了不规则排列的曲细精管、肿胀的精原细胞和大量的空腔结构。100μg/L组尤为显著,出现精原细胞肿胀、部分曲细精管出现固缩和坏死、核浓染和片状结构;暴露各组的睾丸组织中出现沿着头尾轴不连续发育的异常节段;西玛津没有诱导非洲爪蟾产生性别比异常。分别统计暴露期的第60、70、80和90 d西玛津暴露各组中完全变态的非洲爪蟾数量,结果发现,在60和70 d时,西玛津对非洲爪蟾蝌蚪的变态百分比无有显著性的抑制(p0.05),10μg/L西玛津暴露组蝌蚪在第80 d的时间点完全变态百分数显著低于对照组8.1%(p0.05),第90 d的时间点爪蟾完全变态百分数与对照组的相比差异更显著(p0.01,低于22.2%);100μg/L西玛津暴露组蝌蚪在第80天和90 d的时间点完全变态百分数皆分别显著低于对照组13.5%和21.8%(p0.01)。同时,10和100μg/L西玛津也显著的延长了蝌蚪完全变态所需要的天数(p0.01)。西玛津暴露各组的雌雄爪蟾肝脏重量和HSI与对照组相比无显著差异(p0.05),但各暴露组雄性爪蟾的HSI出现了小于雌性的趋势;10和100μg/L西玛津导致肝脏组织出现溶解、坏死,肝脏细胞萎缩。只有0.1μg/L西玛津显著诱导了雌性爪蟾肝脏中的hsp70的表达(p0.05),肝脏组织中的vlga2.hsp90、ar、er、gr基因表达量未被显著影响。筛选出对非洲爪蟾生殖发育影响最大的西玛津浓度是100μg/L,且作为内分泌干扰物西玛津对雄性非洲爪蟾的影响大于雌性,由此,选择雄性非洲爪蟾作为分子实验部分的动物模型。全基因组芯片结果显示,在100 μg/L西玛津暴露组的睾丸组织中共有1315个差异基因,其中上调基因454个,下调基因861个(FC=2且p=0.05)。芯片的原始数据已上传到NCBI Gene Expression Omnibus,序列号为17214940;采用Q-RT-PCR方法对选取基因进行验证的结果与表达谱结果一致;差异表达基因的GO分析结果显示,与生物过程相关的有188个注释条目,与细胞组成相关的有37个注释条目,与分子功能相关的有33个注释条目;通过差异基因的pathway分析,本次实验筛选出5条显著性富集差异基因的通路,分别是精氨酸和脯氨酸代谢通路、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸代谢通路、核黄素代谢通路、细胞周期通路、色氨酸代谢通路。本研究确认了西玛津对两栖类中华大蟾蜍和非洲爪蟾的发育毒性。高剂量的西玛津增加了两栖类的死亡率,降低了GSI,对性腺和肝脏的组织结构产生损伤,延迟或抑制了两栖类的变态,从两种两栖动物的毒理学数据比较来看,中华大蟾蜍对西玛津更加敏感;西玛津对非洲爪蟾肝脏组织基因表达的无影响,可能是由于长期暴露导致机体的调节适应,抑或与肝细胞损伤有关;详细研究了与非洲爪蟾生理学和毒理学终点改变相关联的分子水平的变化。差异基因分析结果暗示,西玛津对雄性非洲爪蟾不是通过诱导芳化酶表达实现雌激素效应的。同时,也未干扰雌激素受体和雄激素受体信号通路。生殖系统和内分泌系统中的差异基因42Sp50,Zpax,wees,acps,ptgs2,th,stc1与西玛津导致的雄性非洲爪蟾的生殖毒性效应密切相关。综合分析推测,西玛津主要通过干扰与类固醇分泌相关的基因的表达,从而引起身体的组织发育和生理功能异常。西玛津对雄性非洲爪蟾的毒性作用模式很有可能是一种综合的新陈代谢调节模式。总之,本研究确认了西玛津对本地种中华大蟾蜍和模式动物非洲爪蟾的发育影响,以及参与雄性非洲爪蟾生殖系统生理学和毒理学终点改变的众多基因和信号通路,为进一步研究西玛津生殖毒性的分子作用机理提供数据支持。使我们能够通过西玛津对两栖类生殖发育的影响,预知和推测其对人类生殖发育的危害。对制定西玛津在我国环境中残留的安全标准、建立环境监测方法和发育毒性的预防策略都有着很高的科学参考价值,最终为建立和完善具有中国特色,并与国际接轨的环境雌激素安全标准化技术体系和数据库奠定坚实的基础。
【关键词】:除草剂 生殖系统 内分泌系统 基因芯片 两栖类
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S481
【目录】:
  • 中文摘要12-17
  • ABSTRACT17-23
  • 符号说明及缩写词23-25
  • 第一章 文献综述25-41
  • 1.1 内分泌干扰物质概述25-31
  • 1.1.1 内分泌干扰物的基本性质25-26
  • 1.1.2 内分泌干扰物的危害性26-29
  • 1.1.2.1 健康危害27-28
  • 1.1.2.2 生态危害28-29
  • 1.1.3 内分泌干扰物质的毒理学研究29-31
  • 1.2 西玛津的研究概况31-33
  • 1.2.1 西玛津的基本性质31-32
  • 1.2.2 西玛津的毒理学研究概况32-33
  • 1.3 分子毒理学的研究概况33-36
  • 1.3.1 分子毒理学研究的热点34-35
  • 1.3.2 分子生物标志物及其应用的研究35
  • 1.3.3 细胞与分子生物学新技术在毒理学的应用35
  • 1.3.4 分子毒理学的未来35-36
  • 1.4 两栖类在内分泌干扰物领域的研究背景36-40
  • 1.4.1 内分泌干扰物对两栖类生殖系统的影响36-38
  • 1.4.1.1 雌雄同体的产生37
  • 1.4.1.1 雌雄同体的产生37-38
  • 1.4.2 内分泌干扰物对两栖类变态的影响38-39
  • 1.4.3 内分泌干扰物对两栖类其他方面的影响39-40
  • 1.5 本课题开展思路及研究内容40-41
  • 第二章 西玛津对中华大蟾蜍发育的影响41-52
  • 2.1 引言41-42
  • 2.2 实验材料与仪器试剂42
  • 2.2.1 主要试剂42
  • 2.2.2 实验仪器42
  • 2.2.3 实验动物42
  • 2.3 实验方法42-44
  • 2.3.1 实验动物中华大蟾蜍的饲养和管理42
  • 2.3.2 暴露实验42-43
  • 2.3.3 一般生长指标观察43
  • 2.3.4 组织切片样本的制备43
  • 2.3.5 性腺组织切片的制备43
  • 2.3.6 生长发育的主要评价指标43-44
  • 2.3.7 统计方法44
  • 2.4 结果与分析44-50
  • 2.4.1 西玛津的实际检测浓度44-45
  • 2.4.2 中华大蟾蜍的死亡率45
  • 2.4.3 西玛津对中华大蟾蜍体重、体长和尾长的影响45-46
  • 2.4.4 西玛津对中华大蟾蜍变态发育的影响46-48
  • 2.4.5 西玛津对中华大蟾蜍性腺发育的影响48-50
  • 2.4.5.1 中华大蟾蜍的性腺组织学观察48-50
  • 2.4.5.2 西玛津对中华大蟾蜍性别比例和性腺形态的影响50
  • 2.5 本章小结50-52
  • 第三章 西玛津对非洲爪蟾生长发育和肝脏相关基因表达的影响52-70
  • 3.1 引言52-54
  • 3.1.1 评价内分泌干扰作用的非洲爪蟾模型52
  • 3.1.2 非洲爪蟾应用于污染物发育毒性的研究52-54
  • 3.1.3 非洲爪蟾的性腺组织形态54
  • 3.2 实验材料和仪器设备54-55
  • 3.2.1 主要试剂54-55
  • 3.2.2 实验仪器55
  • 3.2.3 实验动物55
  • 3.3 实验方法55-59
  • 3.3.1 实验动物非洲爪蟾的饲养和管理56
  • 3.3.2 暴露实验设计56-57
  • 3.3.3 一般生长指标观察57
  • 3.3.4 组织切片样本的制备57
  • 3.3.5 组织切片的制备57
  • 3.3.6 生长发育的主要评价指标57-58
  • 3.3.7 肝脏组织RNA的提取58
  • 3.3.8 cDNA的合成58
  • 3.3.9 引物设计58
  • 3.3.10 Q-RT-PCR反应58-59
  • 3.3.11 统计方法59
  • 3.4 结果与分析59-68
  • 3.4.1 西玛津的实际检测浓度59
  • 3.4.2 非洲爪蟾的死亡率59
  • 3.4.3 非洲爪蟾的一般生长指标59-61
  • 3.4.4 西玛津对非洲爪蟾性腺发育的影响61-63
  • 3.4.4.1 非洲爪蟾的性腺系数61
  • 3.4.4.2 非洲爪蟾的性腺组织学观察61-63
  • 3.4.4.3 非洲爪蟾的性腺形态和性别比例63
  • 3.4.5 非洲爪蟾蝌蚪的变态率和变态时间63-64
  • 3.4.6 西玛津对非洲爪蟾肝脏发育的影响64-66
  • 3.4.6.1 非洲爪蟾的肝脏系数64-65
  • 3.4.6.2 非洲爪蟾的肝脏组织学观察65-66
  • 3.4.7 西玛津对非洲爪蟾肝脏基因表达的影响66-68
  • 3.5 本章小结68-70
  • 第四章 西玛津对非洲爪蟾睾丸组织杂交微阵列芯片表达谱的影响70-91
  • 4.1 引言70-71
  • 4.2 实验材料和仪器设备71-72
  • 4.2.1 芯片组织样本71
  • 4.2.2 杂交微阵列芯片71
  • 4.2.3 主要试剂71-72
  • 4.2.4 主要仪器72
  • 4.2.5 生物信息学网站及分析软件72
  • 4.3 实验方法72-74
  • 4.3.1 性腺组织RNA提取72
  • 4.3.2 探针制备及杂交72
  • 4.3.3 RT-PCR验证基因芯片结果72-74
  • 4.3.4 数据分析74
  • 4.4 结果与分析74-89
  • 4.4.1 杂交微阵列芯片扫描图75
  • 4.4.2 杂交微阵列芯片散点图75-76
  • 4.4.3 杂交微阵列芯片结果76-80
  • 4.4.4 杂交微阵列芯片聚类分析图80
  • 4.4.5 杂交微阵列芯片结果的RT-PCR验证80-82
  • 4.4.6 差异基因的Gene Ontology分析结果82-85
  • 4.4.7 差异基因的Pathway分析结果85-89
  • 4.5 本章小结89-91
  • 总结与展望91-93
  • 附录1 杂交微阵列芯片表达谱改变的详细信息93-152
  • 附录2 GO分析差异表达基因的详细结果152-168
  • 参考文献168-185
  • 致谢185-186
  • 攻读学位期间发表的学术论文186-187
  • 附件187-199

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 余霖霖;杨灵;李轶女;周庆祥;朱越雄;沈桂芳;;高温酸性磷酸酶acp基因的克隆、表达和功能的初步鉴定[J];生物技术通报;2007年02期


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本文编号:407014

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