玫瑰孢链霉菌多效调控基因whiB4对菌体生长发育和达托霉素生物合成的影响

发布时间：2017-06-22 07:06

  本文关键词：玫瑰孢链霉菌多效调控基因whiB4对菌体生长发育和达托霉素生物合成的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 达托霉素是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生的一种脂肽类抗生素。2003年获美国FDA批准用于治疗革兰氏阳性菌引起的复杂皮肤感染和结构性皮肤感染。2006年美国FDA又批准了达托霉素的新适应症,用于治疗由金黄色葡萄球菌引起的菌血症和右侧心内膜炎。达托霉素对高致病耐药菌,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等均有很好的杀菌效果,且毒副作用小,它已成为病原菌最后一道防线一万古霉素的最佳替代品,发展前景广阔。 whiB家族是仅存在放线菌中与菌体生长发育和次级代谢密切相关的一组基因,whiB4是其家族成员之一。研究表明whiB4低表达能够提高阿霉素／柔红霉素、默诺霉素、放线紫红素等多种抗生素的生物合成,而高表达则降低了抗生素的产量。这暗示whiB4可能是抗生素生物合成的负调控基因,是通过基因工程途径提高抗生素产量的一个重要候选基因。本研究经过生物信息学分析,从玫瑰孢链霉菌基因组中克隆到了whiB4,并研究其对玫瑰孢链霉菌发育分化、达托霉素发酵产量的影响,为提高达托霉素发酵产量提供新靶点。 目的： 本文旨在研究Streptomyces roseosporus NRRL15998中whiB4对菌体生长发育及达托霉素生物合成的影响,为Streptomyces roseosporus的菌种改造和提高达托霉素产量寻找新靶点。 方法： 1.优化大肠杆菌介导的Streptomyces roseosporus遗传转化条件,如接合转移的最佳培养基、孢子的预萌发条件、抗生素覆盖时间等。 2.通过生物信息学分析在Streptomyces roseosporus NRRL15998基因序列中找到whiB4,设计引物克隆得到目的基因,分别以pKC1139(?)(?)pSET152为基础构建whiB4的敲除质粒和过表达质粒。 3.通过接合转移导入Streptomyces roseosporus NRRL15998中,筛选whiB4的敲除株,过表达突变株和遗传互补株,并发酵检测达托霉素产量。 RT-qPCR检测与达托霉素生物合成起始相关基因dptE的转录水平变化。 4.通过发酵菌体收集、固体培养和扫描电镜观察Streptomyces roseosporus的菌体生长,孢子形成情况。 结果： 1.优化了Streptomyces roseosporus的接合转移体系,显示AS-1培养基是接合转移的最佳培养基。孢子的预萌发条件为50℃热激10min,抗生素覆盖时间16-18h效果最好。转化效率达10-6～10-5。 2.从Streptomyces roseosporus NRRL15998的基因组中克隆到了、vhiB4基因,成功构建了whiB4敲除载体和过表达载体。接合转移后,筛到阳性菌株,PCR验证确定了whiB4的阻断突变株(whiB4DM)和过表达突变株(whiB4152OM)。 3.发酵检测达托霉素产量,发现whiB4DM较WT产抗能力增加43%,回补株达托霉素产量降低21%。whiB4过表达后,达托霉素产量降低55%。RT-qPCR分析发现whiB4DM中dptE基因的转录水平上调。 4. whiB4DM突变株的孢子形成受阻,菌丝细长不能分隔形成孢子,但是whiB4的敲除并没有显著影响发酵过程中菌体的生长。 结论： 大量研究表明whiB-like基因可能是抗生素生物合成的负调控基因,也是与孢子形成相关的一个重要基因。在Streptomyces roseosporus NRRL15998中whiB4的阻断,抑制了孢子的形成,但促进了达托霉素的生物合成,说明whiB4调控玫瑰孢链霉菌孢子的形成,也是达托霉素生物合成的负调控基因,可能通过调控达托霉素生物合成基因发挥作用,这与之前的研究结果相符。本研究将有助于拓展我们对达托霉素生物合成调控的认识,为代谢工程更好的进行菌种改造提供重要理论依据。
【关键词】：达托霉素 S.roseosporus whiB4 孢子 dptE
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第1章 综述10-20
• 1.1 达托霉素概述10-16
• 1.1.1 达托霉素的理化性质10
• 1.1.2 达托霉素抑菌活性和作用机制10-12
• 1.1.3 达托霉素的临床研究及应用12-14
• 1.1.4 达托霉素的生物合成14-16
• 1.2 达托霉素产生菌S.roseosporus的代谢工程改造16-17
• 1.2.1 提高达托霉素产量16
• 1.2.2 寻找达托霉素结构类似物16-17
• 1.3 whiB-like(wbl)基因家族17-20
• 1.3.1 wbl基因家族的发现17
• 1.3.2 wbl基因家族的生物学功能17-20
• 第2章 绪论20-22
• 第3章 实验材料和方法22-36
• 3.1 材料22-25
• 3.1.1 菌株及质粒22
• 3.1.2 培养基22-23
• 3.1.3 常用抗生素23-24
• 3.1.4 引物24-25
• 3.1.5 实验试剂25
• 3.1.6 主要仪器25
• 3.2 实验方法25-36
• 3.2.1 常规实验方法25-29
• 3.2.2 接合转移体系的优化29-30
• 3.2.3 whiB4敲除突变株和过表达菌株的构建和筛选30-31
• 3.2.4 达托霉素生物活性检测以及菌体生长曲线测定31-32
• 3.2.5 RNA提取,RT-PCR,RT-qPCR32-36
• 第4章 实验结果与分析36-50
• 4.1 S roseosporus遗传转化系统的优化36-39
• 4.1.1 抗生素最小抑菌浓度(MIC)的测定36
• 4.1.2 培养基对接合转移的影响36
• 4.1.3 抗生素覆盖时间和受体孢子数对接合转移的影响36-37
• 4.1.4 转化子的稳定性考察37
• 4.1.5 接合转移接合子的验证37-38
• 4.1.6 安普霉素抗性基因的特异性敲除38-39
• 4.2 S roseosporus15998 whiB4基因的克隆和生物信息学分析39-40
• 4.3 whiB4敲除和过表达载体的构建40-41
• 4.4 whiB4突变菌株的筛选41-43
• 4.4.1 whiB4敲除突变株的筛选41-42
• 4.4.2 whiB4过表达菌株的筛选42-43
• 4.4.3 whiB4敲除突变株的遗传互补43
• 4.5 whiB4敲除突变株的表型观察43-44
• 4.6 whiB4阻断和过表达对达托霉素生物合成的影响44-47
• 4.6.1 whiB4敲除对达托霉素生物合成的影响44-46
• 4.6.2 whiB4过表达对达托霉素生物合成的影响46-47
• 4.7 基因dptE和whiB4转录水平差异分析47-50
• 4.7.1 总RNA的提取47
• 4.7.2 基因dptE和whiB4转录水平检测及分析47-50
• 第5章 讨论与展望50-54
• 5.1 whiB4对S.roseosporus15998生长发育的影响50-51
• 5.2 whiB4对达托霉素生物合成的影响51
• 5.3 展望51-54
• 参考文献54-60
• 硕士期间发表论文和奖励情况60-62
• 致谢62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 杨e

本文编号：470976