基于微小凹图式的C17.2细胞三维聚集体形成及其电生物物理特性研究

发布时间：2017-09-02 20:08

  本文关键词：基于微小凹图式的C17.2细胞三维聚集体形成及其电生物物理特性研究

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【摘要】：细胞的体外培养是生命科学研究的基础，而将细胞体外培养时的生长状态调整到与体内细胞类似的生长状态是广大科研工作者一致在努力追求的目标。体外三维培养是最理想的解决办法。然而目前大部分的三维培养方法或多或少存在细胞生长均一性较差、结构构型不均匀、不利于进行光学检测等问题。以微小凹结构为代表的三维聚集体培养方法是近些年较多研究的新方法，能一定程度上克服上述问题。但目前此类方法还不能同时实现使细胞即能充分的进行养分交换又能与基底有一定的粘附，从而较为准确的还原体内细胞的生长状态。本研究将先解决这一问题，构建一个基于细胞凹面剥离行为的C17.2神经干细胞三维聚集体培养基底。 我们基于紫外光光刻技术和软光刻技术制备了9种微小凹图式结构其中6种结构为五连孔微小凹，使用材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolicacid，PLGA)和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)。与C17.2神经干细胞的初步复合培养结果显示，基底在经过等离子氧蚀刻和多聚赖氨酸裱衬后，细胞接种后能快速进入微小凹，并能很好的在其上贴壁生长，而不同材质的基底对细胞生长和分布的影响几乎没有差异。C17.2细胞在微小凹中以扩增条件培养2天后仍维持均一的干细胞特性，这初步说明基底拓扑形貌的变化不会使C17.2细胞发生分化。 利用延迟拍摄技术对同一微小凹内细胞行为的观察发现C17.2细胞接种后一开始逐渐贴壁，并相互连接成细胞串，随着培养时间增加，细胞串将从微小凹侧壁上剥落，并形成三维悬浮生长的细胞聚集体。利用扫描电镜也观察到类似的结果。CFSE荧光染色结果显示大部分三维生长细胞位于微小凹中靠近小凹口的区域悬浮生长。通过Logistic回归分析，发现较小的孔径和较窄的通道宽度有利于细胞聚集体的形成。结合细胞增殖统计结果发现，D80-W20和D100-W20结构的细胞倍增时间最短，同时这两种结构中细胞聚集体的形成率也最高。对F-actin和vinculin进行免疫荧光染色发现，细胞未形成成熟的粘着斑，但骨架排布有一定的差异。 通过有限元方法对细胞串在微小凹侧面上剥离行为的模拟，发现微小凹模型中的初始剥离发生时的预应力(Critical peeling prestress，CPP)远小于平面模型中的CPP值，说明细胞在微小凹侧壁上比在平面培养时更容易剥离下来。而6种不同微小凹之间的CPP差异并不明显。通过对细胞瞬时弹性模量(Cell instantaneouselastic modulus，EC)和粘附层弹性模量(Adhesion interface elastic modulus，EA)这两个参数进行全面考察，发现反应细胞剥离能力的PM/F(微小凹模型的CPP与平面模型的CPP的比值)与kC/A(EC与EA的比值)有较好的正相关性。 上述研究表明，结合细胞的凹面剥离行为，我们成功的构建了一种可用于C17.2神经干细胞三维化悬浮生长的培养基底。 本研究的另一方面将聚焦于评价不同生长状态C17.2细胞的电生物物理特性上。静息膜电位(Resting membrane potential，RMP)是细胞的一个重要的电生物物理指标，它对许多功能性的膜蛋白具有调节作用，从而实现电刺激信号到细胞内化学信号的转换，并进而影响细胞的增殖、分化、凋亡等。然而目前利用膜片钳技术要实现对聚集体内细胞的膜电位检测存在困难，因此本研究将使用电势荧光染料作为指示剂实现C17.2细胞膜电位的检测，同时将改进现有该技术检测精度不高的缺陷。由于细胞膜钠钾通透性比值(PNa/K)能一定程度反映出细胞膜上不同离子通道的发育程度，因此我们RMP检测方法的基础上对这个电生物物理指标进行检测。 研究中我们首次将双结合位点的拟合方法用于对细胞核区四甲基罗丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)非特异性吸附量的标定，对梯度高钾去极化的C17.2细胞进行RMP检测发现用TMRM法检测到的膜电位值与用膜片钳检测到的值基本一致，这很好的证明了此方法的可靠性和准确性。同时在利用CoroNa进行了胞内钠离子浓度的检测的基础上，结合戈德曼(Goldman)方程对细胞膜钠钾通透性比值进行了计算。最后将建立的新方法与Loew建立的方法以及我们前期采用的方法进行了比较，结果显示新方法比以往方法精度更高。 我们进而对不同生长状态的C17.2细胞的电生物物理特性进行了考察。先对不同生长天数的C17.2细胞的RMP和PNa/K进行了检测，在细胞接种前3天，细胞膜电位存在一个逐渐变负的过程。之后我们采用了五种分化方法对C17.2细胞进行分化，最终选择了分化结果较为稳定的利用多聚赖氨酸进行基底裱衬来诱导分化的方法。通过形态学和免疫荧光检测发现大部分细胞都已经开始分化，，但还未完全分化成成熟的神经元。进行的电生物物理检测发现，C17.2细胞虽然已经开始分化，但其RMP和PNa/K还没有发生显著变化。最后我们检测了在D80-W40微小凹中的C17.2细胞的RMP和PNa/K，结果表明三维生长的C17.2细胞的RMP比平面生长的细胞要更正，PNa/K也要更高。 在上一部分的研究中我们首次利用双结合位点的拟合方法提高了基于TMRM的电位检测精度，并实现了不同生长状态的C17.2细胞的电生物物理特性的评价。 综上，本研究中我们制备了一种连孔微小凹基底，生长于其中的C17.2神经干细胞将自组装成悬浮生长的三维细胞聚集体。这将为体外研究神经干细胞的增殖、分化等行为提供一个很好的平台，同时还可用于基于细胞的生物传感器领域。本研究中我们还建立了一种具有较高精度的非侵入性的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值的检测方法，这将弥补膜片钳技术的一些不足。在此基础上对C17.2神经干细胞的不同状态的电生物物理特性研究对认识神经干细胞的生长发育过程具有重要意义。
【关键词】：细胞聚集体 神经干细胞 有限元分析 TMRM 静息膜电位
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-9
• 目录9-11
• 主要缩略词11-12
• 1 绪论12-30
• 1.1 问题的提出及研究意义12-15
• 1.1.1 构建用于神经干细胞体外三维培养的阵列基底12-13
• 1.1.2 基于 TMRM 的细胞电生物物理评价方法13-15
• 1.2 国内外研究现状15-26
• 1.2.1 基于 MEMS 的细胞体外培养技术的研究现状15-17
• 1.2.2 凹形结构在细胞培养中的应用及细胞在其中的生长行为分析17-20
• 1.2.3 细胞力学模型的研究进展20-23
• 1.2.4 基于 TMRM 的电位检测方法的研究现状23-26
• 1.3 本文研究的目的和研究内容26-30
• 1.3.1 本文研究的目的26
• 1.3.2 本文研究的主要内容26-27
• 1.3.3 本文研究的创新点27-30
• 2 微小凹图式的制备及与 C17.2 细胞的初步复合30-44
• 2.1 引言30-31
• 2.2 实验材料与方法31-35
• 2.2.1 实验试剂与仪器31-32
• 2.2.2 实验方法32-35
• 2.3 结果与讨论35-41
• 2.3.1 硅主模和 PDMS 模具的加工35-36
• 2.3.2 微小凹图式基底的制备36-37
• 2.3.3 微小凹图式表面的亲水化处理及表征37-39
• 2.3.4 C17.2 细胞与不同材料微小凹图式的初步复合39-40
• 2.3.5 细胞在微小凹中的干细胞特性考察40-41
• 2.4 小结41-44
• 3 微小凹内三维细胞聚集体的形成44-60
• 3.1 引言44-45
• 3.2 实验材料与方法45-47
• 3.2.1 实验试剂与仪器45
• 3.2.2 实验方法45-47
• 3.3 结果与讨论47-59
• 3.3.1 C17.2 细胞在微小凹中形成三维细胞聚集体的过程47-51
• 3.3.2 C17.2 细胞在微小凹中的增殖统计51-53
• 3.3.3 微小凹中细胞聚集体形成过程的荧光染色及统计分析53-58
• 3.3.4 C17.2 细胞的骨架和粘着斑蛋白染色58-59
• 3.4 小结59-60
• 4 细胞凹面剥离行为的有限元模拟60-80
• 4.1 引言60-61
• 4.2 实验材料与方法61-66
• 4.2.1 实验方法61-66
• 4.3 结果与讨论66-77
• 4.3.1 连孔微小凹模型与平面模型的有限元模拟66-70
• 4.3.2 影响细胞剥离的力学参数70-75
• 4.3.3 不同细胞在凹面中的剥离能力75-77
• 4.4 小结77-80
• 5 基于 TMRM 的细胞电生物物理评价体系的建立80-100
• 5.1 引言80-81
• 5.2 实验材料与方法81-86
• 5.2.1 实验试剂与仪器81
• 5.2.2 实验方法81-86
• 5.3 结果与讨论86-98
• 5.3.1 TMRM 荧光强度的线性标定86-87
• 5.3.2 TMRM 检测参数的确立87-89
• 5.3.3 TMRM 染料的荧光红移分析89-90
• 5.3.4 TMRM 非特异性吸附的标定90-91
• 5.3.5 梯度去极化时 RMP 检测及膜片钳验证91-92
• 5.3.6 胞内钠离子浓度的检测方法的建立92-94
• 5.3.7 钠钾通透性比值检测方法的建立94-96
• 5.3.8 与 Loew 的方法和课题组前期的方法进行对比96-98
• 5.4 小结98-100
• 6 C17.2 细胞在不同生长状态中的电生物物理特性100-114
• 6.1 引言100
• 6.2 实验材料与方法100-104
• 6.2.1 实验试剂与仪器100-102
• 6.2.2 实验方法102-104
• 6.3 结果与讨论104-112
• 6.3.1 不同培养天数的 C17.2 细胞的电生物物理评价104-105
• 6.3.2 C17.2 细胞的分化及其电生物物理评价105-110
• 6.3.3 三维化生长的细胞的电生物物理评价110-112
• 6.4 小结112-114
• 7 结论与展望114-118
• 7.1 主要结论114-115
• 7.2 后续研究工作的展望115-118
• 致谢118-120
• 参考文献120-134
• 附录134
• A. 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录134
• B. 作者在攻读博士学位期间取得的科研成果目录134
• C. 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目134

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张利光;吴泽志;宋兆全;黄岂平;廖彦剑;;三维微小凹图式的制备及其与C17.2神经干细胞的复合[J];生物医学工程学杂志;2012年03期

本文编号：780608