特氏杜氏藻响应三乙胺胁迫转录组及己糖转运蛋白分析

发布时间：2020-10-09 20:41

　　产油微藻是指在细胞内能积累油脂超过其干重20%的微藻,由于其强的固碳能力、不占用农耕面积、生长速度快等优点,是很好的生物柴油原料,同时因具备丰富的活性成分,因此被认为是生物燃料的备选藻种之一,也是食品的和营养添加剂的良好来源。但目前实验条件下油脂的产量无法达到大规模工业化的生产要求,因此从基因转录水平,阐述特氏杜氏藻在三乙胺胁迫下产氢的分子机制以及挖掘出与特氏杜氏藻产油脂相关的重要功能基因,可以为日后构建高产油的藻株提供实验理由依据。本论文以Dunaliella tertiolecta(特氏杜氏藻)为主要研究对象,探索了在三乙胺胁迫条件下,特氏杜氏的油脂积累和己糖转移蛋白的分析。提取特氏杜氏藻和在三乙胺胁迫下培养的特氏杜氏藻的总RNA;利用Illumina HiSeq4000,并结合生物信息学方法,分析特氏杜氏藻在产油脂过程中的转录组间的基因表达差异。己糖转移蛋白是细胞内碳源运输的重要工具,其表达量从侧面反应了碳源的流动方向。本论文,从特氏杜氏藻中克隆到了4个己糖转移蛋白,分析了蛋白的生物信息学功能,并就其表达量进行分析。得到的结果如下:在转录组实验中,三组对应的对照组和实验组分别得到4500个左右的差异基因,其中,基因表达下调的基因有3400条左右,差异比较小,而基因表达上调大概有3500条左右。说明三乙胺胁迫后基因的表达以及细胞的生理均发生显著变化。通过Pathway和GO功能分析得知差异表达基因主要与甘油脂肪酸合成、脂肪酸的延长和磷酸戊糖途径有关,特别是Pathway分析中所发现脂肪酸生物合成和不饱和脂肪酸合成中相关基因发生显著的上调表达则是油脂积累及脂肪酸组分变化对三乙胺胁迫响应的直接证据。进一步挖掘特氏杜氏产油脂的关键基因,在甘油脂肪合成中生成甘油的途径中,基因表达上调的有乙醛脱氢酶、甘油激酶、磷脂:甘油二酯酰基转移酶,而二羟基丙酮激酶基因的表达下调了。脂肪酸的延长代谢途径,反式-2-烯脂酰-辅酶A还原酶出现了单个基因的上调。在磷酸戊糖途径中,发生上调的基因有3-磷酸甘油醛脱氢酶和葡萄酸激酶,发生下调的基因是6-磷酸葡糖酸脱氢酶、核糖磷酸焦磷酸激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,这有利于6-磷酸葡萄糖的生成,进而产生更多的NADPH和三磷酸甘油。保守结构域分析发现Dt HXTs存在己糖转运蛋白特有的结构域MSF transporterfamily、MSF1 transporter family。通过细胞定位分析,发现DtHXT1为分泌蛋白,其有可能锚定在细胞膜上,DtHXT2定位在线粒体上,DtHXT3和Dt HXT4定位在质体上。同源比对发现,DtHXT2与绿藻类的莱茵衣藻的亲源性最近,DtHXT3与它们之间也有一定的亲缘性。Dt HXT1和DtHXT4与上述基因的亲源性则较低。DtHXTs基因的表达量分析表明,在三乙胺的胁迫下,DtHXT1表达量上调了54.55%,而DtHXT2的表达量则上调了26.72%。这有利于葡萄糖向胞内和线粒体转运。另一方面,DtHXT3和Dt HXT4定位于质体上,其表达量的都下调29%左右,这有利于葡萄糖在叶绿体中的积累,有利于脂肪等的存储性物质的生成。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;TE667
【部分图文】：

三酰甘油,生物合成,脂肪酸,卡尔

11图 1-1 自养和异养微藻的脂肪和三酰甘油代谢途径. 1-1. Fatty acid and TAG biosynthesis pathway in microalgae under autotrophiheterotrophic growth conditions.谢包含卡尔文·本森循环，三酰甘油生物合成和脂肪酸生物合成。卡尔文二氧化碳和其他化合物转化为葡萄糖的化学反应。脂肪酸生物合成是由乙ADPH 产生脂肪酸。三酰甘油生物合成是将乙酰-CoA 和 G3P 转化为 TAG Accase，乙酰辅酶 A 羧化酶；CA，碳酸酐酶；DGAT，1,2-二酰甘油酰基转二半乳糖基二酰甘油合酶；DGK，1,2-二酰甘油激酶；FAT，脂肪酰基-ACGPAT，甘油-3-磷酸 O-酰基转移酶；HAD，β-羟酰-ACP 脱水酶；KAR，3-氧；KAS，3-氧酰基-ACP 合酶 II；LPAAT，溶血磷脂酰基转移酶；LACS， A 合成酶；MAT，丙二酰辅 A；ACP 转酰基酶；MCAT，酰基载体蛋白（

曲线图,质量检测,曲线图,转录本

EF图 2-1 RNA 质量检测曲线图Fig. 2-1 RNAquality detection curve注：ACE 分别为对照的三个重复样本，BDF 分别为三乙胺处理的三个重复样本。2.4.2 转录组测序产量统计本实验采用 Illumina Hiseq 平台一共测了 39.9 Gb 数据。组装并去冗余后得到65925 个 Unigene，总长度 68749410bp，平均长度 1042bp，N50 为 1907bp 以及 GC 含量分别为 56.46%。根据注释结果共检测出 33932 个 CDS ，未注释上的 Unigene 使用ESTScan 预测后获得 11510 个 CDS 。同时还检测出 39372 个 SSR 分布于 20113 个Unigene 中，以及预测出 356 个编码转录因子的 Unigene。从表 2-5 中可以看出，其从转录本的 N50 可以看出，其数值都超过了 1300，所以本次实验所组装出来的 6 个样本质量都很高，另外从转录本的长度分布图可以看出，其中达到 3000bp 的数量都达到 1600 条以上，也说明了其组装质量很高。

转录本,长度分布图,三乙胺

（条）CK 170337 523180161302 725 283 56.91CK 269365 518104671312 735 283 56.91CK 367716 522773861355 773 293 56.7三乙胺 151011 407341241326 793 314 57.65三乙胺 270114 525170071301 732 283 57.11三乙胺 366841 513309551347 776 288 57.05N50: 用于衡量组装的连续性，数值越大说明组装效果越好，计算方法为：按转录本长度从大小排序后逐个累加至所有转录本总长度的 50%时，最后一个累加的数值大小即为N50。 GC(%): 碱基 G 和 C 的比例。

【参考文献】