应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选

发布时间：2018-03-02 19:09

本文选题：旋毛虫幼虫　切入点：侵入　出处：《郑州大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：旋毛形线虫[Trichinella spiralis (Owen,1835) Railliet,1895],简称旋毛虫,是一种成虫和幼虫分别寄生在同一宿主的小肠和骨骼肌细胞内的线虫。旋毛虫引起的旋毛虫病(trichinellosis)是一种危害非常严重的食源性人兽共患寄生虫病。当人或动物生食或半生食含旋毛虫的肉类后,幼虫在胃液的作用下被消化脱囊释放出来,迅速进入小肠中的多细胞内龛中。在感染性第一期幼虫钻入肠道柱状上皮细胞内龛后,称之为旋毛虫肠道感染性第一期幼虫(L1)；经29-36h完成4次蜕皮(L1-L4)后发育为成虫,雌雄交配,96h后产出新生幼虫,新生幼虫经血循环移行到肌肉组织,幼虫在肌肉中可以生存数年而保持感染性。因此,脱囊幼虫(肠道感染性第1期幼虫)侵入肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道排出,是旋毛虫能否导致宿主感染与致病的关键步骤。尽管旋毛虫侵入肠上皮细胞的体外模型已建立,但是感染性幼虫对肠上皮细胞的识别,侵入和移行的机制均不完全清楚。本研究模拟旋毛虫感染宿主的环境,将感染性幼虫与小肠上皮细胞在体外共培养,对培养前后的虫体蛋白和细胞蛋白进行SDS-PAGE分离,联合Western blot挑选出有差异的条带,采用shotgun液相色谱串联质谱系统进行鉴定,将质谱分析得到的数据应用SEQUEST软件及数据库搜索完成蛋白质的鉴定,检测旋毛虫感染性幼虫在侵入小肠上皮细胞前后虫体蛋白和细胞蛋白的变化,并对鉴定出的蛋白质从分子功能、生物学途径、亚细胞定位三个方面进行GOA分类。幼虫与细胞接触后早期表达的蛋白可能是其侵入的相关蛋白,幼虫早期表达的蛋白抗原对本病的早期诊断也可能具有重要价值。这些研究将为更深入了解旋毛虫侵入肠上皮细胞机制提供有力的数据支持和参考。材料与方法 1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞系本实验所用的旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫(Trichinella spiralis),由本室昆明小鼠传代保种。20只雄性6周龄昆明小鼠(清洁级),体重20g-25g,均购自郑州大学医学院实验动物中心。人回盲肠癌细胞HCT-8[HRT-18]购于中国科学院细胞库。 2.旋毛虫肌幼虫的收集与激活将旋毛虫肌幼虫按照300条/只经口感染50只昆明小鼠,42 d后脱颈椎处死。膈肌压片镜检证实感染成功后,剥皮、除内脏和脂肪,用搅拌器搅碎至肌肉完全搅碎。采用人工消化法消化4 h,按贝氏法收集肌幼虫。将收集的肌幼虫用含5%人胆汁的PBS在37℃5%C02条件下孵育2-3 h,用PBS洗涤3次后,加入含抗生素的PBS中37℃孵育1h备用。 3.细胞培养将HCT-8细胞接种在RPMI-1640完全培养基中,在37℃5%CO2培养箱培养,2-3 d即可形成致密的单细胞层,此时用于接种肌幼虫。在接种前1d按照常规方法给细胞换液,以及时去除死细胞,保证细胞状态良好。 4.旋毛虫虫体蛋白和HCT-8细胞蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定将激活的肌幼虫与RPMI-1640培养基按5000条/ml的比例混合后加入长满HCT-8细胞的75m1培养瓶中,37℃5%CO2条件下培养18h后,去除培养基与幼虫,收集肌幼虫,加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后收集细胞,按比例分别加入RIPA裂解液提取虫体蛋白和细胞蛋白。BCA法测得虫体蛋白和细胞蛋白后,利用SDS-PAGE及蛋白质印迹(Western blot)进行分析。 5. LC-MS/MS分析根据Western blot的结果,比对胶上相匹配的差异条带。用手术刀片将胶上差异部分切割下来,胰酶酶解、抽提肽段,酶解后得到的肽段提取物使用LC-MS/MS系统进行分析,质谱设备为Finnigan线性离子阱串联质潜仪LTQ.microspray模式。质谱仪配置C-18反相色谱柱,流动相A相为0.1%溶于超纯水的甲酸,B相为0.1%溶于乙睛水溶液中的甲酸。肽段混合物的洗脱梯度：2%～80%,洗脱时间60min,重复三次。串联质谱分析包括一个全扫描(fullMS scan)和十个串联扫描(MS/MS scan)。 6.质谱数据分析和处理数据搜索引擎为Bioworks version3.2 software(SEQUSET, Thermo Electron)软件进行数据库搜索。肽段数据经SEQUEST过滤、匹配,只有分值较高的肽段被保留。过滤参数为：当Charge+1, Xcorr≥1.9;当Charge+2, Xcorr≥2.2;当Charge+3, Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1。最后得到胰酶消化的蛋白质信息列表数据。 7. InterPro注解和GO分类使用EXPASY工具在线分析蛋白质的基本理化性质(包括分子量Mr、等电点pI等),最后用图表进行展示。使用InterProscan软件完成对蛋白序列的搜索。采用GO工具,从生物学途径、亚细胞定位及分子功能三方面对蛋白质表达谱进行功能分析及分类,并通过WEGO在线分析展示各部分分布。结果 1.幼虫与HCT-8细胞培养后虫体蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析SDS-PAGE结果表明,在培养基中培养18h的虫体抗原有41条蛋白带。HCT-8细胞与幼虫培养后的虫体蛋白增加了9条蛋白带(15、29、31、35、37、58、69、121和132 kDa),减少了4条蛋白带(12、17、40、51 kDa)。Western blot结果显示,幼虫在培养基中孵育18h后虫体蛋白能够被旋毛虫感染鼠血清识别的有18条带,分子量范围为18 kDa-135 kDa,幼虫和HCT-8细胞孵育后与仅在培养基中孵育的幼虫相比,被旋毛虫感染鼠血清多识别了7条蛋白带(21、28、30、36、58、77和123 kDa),少识别了3条蛋白带(23、51、97 kDa)。 2.LC-MS/MS分析和鉴定旋毛虫幼虫蛋白旋毛虫感染性幼虫和HCT-8细胞共孵育后,被感染旋毛虫鼠血清识别的3条蛋白带被从胶上切离下来,分子量分别为21、36及58 kDa。应用shotgun LC-MS/MS和生物信息学分析,共有211个非冗余蛋白质被鉴定出来。在高可信度蛋白质当中,有67.8%的蛋白相对分子量范围为20 kDa～65 kDa。对于等电点来说,有123种(58.3%)蛋白质的等电点范围为4～7,58种(28.9%)蛋白的等电点范围为8～10。少于8.5%的蛋白等电点范围为7～8,10种(3.8%)蛋白质具有较高的等电点(大于10)。 3.旋毛虫幼虫蛋白根据GO进行功能分类对鉴定出的旋毛虫的211种蛋白,利用GO工具,从生物学过程、分子功能和细胞定位三个方面进行分类。旋毛虫蛋白的分子功能共分为10大类,其中催化活性(75种蛋白,17.5%)和蛋白结合(110种蛋白,25.6%)是两大主要功能。大部分的细胞和代谢过程与大分子的合成和降解有关,尤其是糖类,核苷酸和蛋白可能是感染性幼虫在发育和生长过程中释放出来的。在211种蛋白中,139种蛋白位于细胞中,105种位于细胞器中。 4.HCT-8细胞与幼虫培养后细胞蛋白的SDS-PAGE与Western blot分析SDS-PAGE结果表明,正常的HCT-8细胞有44条蛋白带。HCT-8细胞与幼虫培养后的细胞蛋白与正常HCT-8细胞蛋白相比增加了5条蛋白带(19、34、61、128和132 kDa),减少了1条蛋白带(118 kDa)。Western blot结果显示,正常HCT-8细胞的蛋白能够被旋毛虫感染鼠血消识别的有5条带,分子量范围为30～129 kDa; HCT-8细胞与幼虫培养后与培养前的HCT-8细胞相比,被旋毛虫感染鼠血清多识别了4条蛋白带(24、35、61和115 kDa)。 5. LC-MS/MS分析HCT-8细胞蛋白HCT-8细胞与幼虫共孵育后,被旋毛虫感染鼠血清多识别的细胞蛋白的分子量分别为24、35、61 kDa,将这3条蛋白带通过shotgun LC-MS/MS进行进一步分析。共有64种非冗余蛋白被鉴定出来。有43种蛋白(67.2%)分子量范围分布在10～70 kDa。等电点的范围为4.7～10.92,其中有26种蛋白(40.6%)的等电点在5～6。 6.HCT-8细胞与幼虫共孵育后增加的蛋白通过GO进行基因分类利用GO工具,64种非冗余蛋白中共有54种蛋白质的功能已知。肠上皮细胞与幼虫共孵育后细胞中的旋毛虫蛋白有注解的与细胞成分有关。其中46种蛋白在细胞中,35种在细胞器中。根据GO的分子功能分类,共可分为7大类,其中结合功能(43,79.6%)和催化活性(23,42.6%)仍然是两大主要功能。大部分的蛋白参与了生物进程,主要是细胞过程、新陈代谢、生物进程的调控及应激和信号传导。结论 1.旋毛虫幼虫与HCT-8细胞培养后,被感染鼠血清多识别的7条虫体蛋白带(21、28、30、36、58、77和123 kDa)可能是幼虫与细胞接触后分泌的新蛋白；少识别的3条蛋白带(23、51、97 kDa)可能是被HCT-8细胞释放的蛋白酶水解掉的虫体蛋白或是虫体发育过程中期特异性蛋白的改变。 2.HCT-8细胞与旋毛虫幼虫与培养后,被感染鼠血清多识别的4条细胞蛋白带(24、35、61和115 kDa),可能是进入细胞内的虫体分泌蛋白。 3.对6条蛋白带(虫体蛋白的21、36和58 kDa及细胞蛋白的24、35和61kDa)应用shotgun分别鉴定出了211种和64种旋毛虫蛋白,初步建立了可能与旋毛虫侵入肠上皮细胞有关的蛋白质组数据库,为旋毛虫幼虫侵入蛋白的进一步筛选与鉴定奠定了基础。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R383.13

【参考文献】