基于光谱和成像技术的香梨黑斑病发病过程监测与快速检测方法研究

发布时间：2020-06-19 04:47

【摘要】：库尔勒香梨鲜嫩多汁,香甜可口,深受广大消费者的喜爱,目前已出口到多个国家和地区,可实现一年四季的销售。但在贮藏、销售过程中,梨果实极易受到多种病害的影响,其中,由链格孢菌(A.alternata)侵染引起的黑斑病是一种最严重的贮藏期病害。黑斑病的发生降低了香梨果实的品质与商品价值,影响其销售,造成严重的经济损失。因此,开展香梨果实黑斑病发病过程监测与快速检测方法研究,实现香梨采后病害动态监测与早期快速检测,对香梨果实病害防治及提高市售果实品质具有十分重要的意义。本论文以库尔勒香梨果实为研究对象,首先,采用高光谱成像(HSI)技术从宏观角度对香梨果实黑斑病发病过程进行动态监测,建立病害早期检测方法;其次,借助共聚焦显微拉曼光谱(CRM)和拉曼化学成像技术对黑斑病发病过程中香梨果实细胞壁成分和结构变化进行研究;再次,基于表面增强拉曼光谱(SERS)对A.alternata侵染产生的交链孢酚及黑斑病发病过程中香梨果实多酚氧化酶(PPO)活性变化进行准确测定;最后,利用SERS对香梨果实中A.alternata含量进行快速检测。主要研究内容和结果如下:(1)基于HSI技术的梨黑斑病发病过程监测及病害早期检测。1)利用HSI系统采集不同染病阶段梨果实的高光谱图像;2)创新地采用光谱角填图(SAM)算法对采集到的高光谱图像进行可视化,识别染病区域;3)利用主成分分析(PCA)来判断基于HSI技术识别不同染病阶段梨果实的可行性,再利用偏最小二乘判别分析(PLSDA)、k最近邻(KNN)和支持向量机(SVM)算法建立梨果实黑斑病病害早期检测的分类模型。结果表明,借助SAM可完成对不同染病阶段病害果实染病区域的识别,从而实现对梨果实黑斑病发病过程的实时监测;PLSDA、KNN和SVM三种分类模型均可用于对不同染病阶段梨果实的分类,但它们的分类精度相差较大。三种模型中,SVM的区分性能最好,其基于全波段光谱和最优波长建模的精度分别为97.50%和96.56%,可实现对梨果实黑斑病病害的早期检测。(2)借助拉曼成像技术对发病过程中梨果实细胞壁成分变化的微观检测。1)利用CRM采集新鲜、染病早期和晚期梨果实细胞壁的拉曼光谱,借助标准品的拉曼光谱和相关文献报道确定梨果实细胞壁拉曼峰的归属,计算发病过程中纤维素和果胶拉曼特征峰强度变化的程度;2)利用PCA对不同染病阶段梨果实细胞壁拉曼光谱进行分类;3)对梨果实细胞壁主要成分(多糖、纤维素和果胶)进行拉曼化学成像,观察梨果实细胞壁在发病过程中的细微变化。结果表明,黑斑病发病过程中细胞壁主要化学成分的含量显著下降,与新鲜果实相比,接种后的第2和第8天,染病果实细胞壁纤维素拉曼特征峰强度分别降低了19.11%和58.50%,果胶拉曼特征峰强度分别降低了19.20%和58.67%;拉曼化学成像结果显示,发病过程中梨果实细胞壁结构受损,空间有序结构遭到破坏,多种成分分布不均匀且变得松散。(3)基于SERS对A.alternata侵染产生交链孢酚的检测。1)制备银纳米颗粒(AgNPs)溶胶,通过吡啶修饰AgNPs溶胶来解决基底与目标分析物吸附力弱的问题;2)建立SERS强度与交链孢酚标准溶液浓度的定量关系,通过加标回收实验来验证其在梨果实中交链孢酚检测的可行性;3)采用SERS对三种不同香梨果实样品中交链孢酚进行检测,并通过HPLC分析来验证SERS对实际样品检测结果的可靠性。结果表明,经吡啶修饰的AgNPs很好地解决交链孢酚在AgNPs表面上吸附能力弱的问题,从而提高检测灵敏度、降低检测限。SERS对交链孢酚检测结果:SERS强度与交链孢酚溶液浓度的关系为I=1453.7 log c-553.4,其决定系数R~2为0.9926,线性范围为3.16-316.0μg/L,检测限为1.30μg/L(低于HPLC分析的检测限)。此外,SERS还成功用于香梨果实中交链孢酚的快速检测,其结果与HPLC分析所得的结果比较接近,相对标准偏差小于10%。(4)基于SERS对发病过程中梨果实PPO活性变化的测定。1)制备一种常用的AgNPs溶胶,将其用作SERS对邻苯二酚测定的基底,确定用于PPO活性测定的最佳邻苯二酚浓度范围;2)采集反应介质在不同反应阶段的SERS信号,并建立SERS强度减量(ΔI)与PPO活性(E_c)之间的关系;3)依据所建立的关系对香梨果实样品中PPO活性进行测定,同时与比色法结果对比分析;4)明确黑斑病发病过程中香梨果实PPO活性变化的规律。结果表明,用于PPO活性测定最佳的邻苯二酚浓度范围为1.0-9.0 mM;对PPO标准溶液测定得到SERS强度减量与PPO活性的线性回归方程为logΔI/Δt=0.6223 log E_c+0.8072,其决定系数为0.9689,线性范围为500-50000 U/L,检测限为224.65 U/L;SERS可用于香梨果实PPO活性的准确测定,其测定结果稳定性比比色法要好;且能够实现对黑斑病发病过程中PPO活性变化的灵敏测定,在接种后的第2天,香梨果实的PPO活性达到高峰值;草酸处理可以增强染病果实的PPO活性,并能延长PPO活性处于高峰值的时间。(5)基于SERS对梨果实中A.alternata的快速检测。1)制备银纳米点阵列基底,并优化基底的颗粒大小与厚度,以获得理想的SERS增强效果和重现性;2)测定水和香梨果实中不同浓度A.alternata的SERS信号,建立SERS信号强度与A.alternata浓度之间的关系,实现A.alternata的快速检测;3)通过拉曼成像对不同浓度A.alternata进行可视化检测。结果表明,SERS可用于A.alternata菌悬液的快速检测,其拟合方程为y=-18.84 x~2+665.38 x-1813.12,决定系数为0.9511,检测范围为1.0×10~3-1.0×10~7 cfu/mL,检测限低至1.0×10~3 cfu/mL;通过拉曼成像可检测到A.alternata菌悬液最低浓度为1.0×10~4 cfu/mL,适宜的检测范围为1.0×10~4-1.0×10~7 cfu/mL。对人工污染香梨果实汁液检测的结果如下:SERS强度与汁液中A.alternata浓度的拟合方程为y=-29.27 x~2+511.47 x-1435.18,决定系数为0.9852,检测限低于10~4 cfu/mL。开展香梨黑斑病发病过程监测与快速检测方法研究,实现香梨果实采后病害的动态监测及发病过程中生理生化指标的快速检测,其研究成果为病原菌侵染及果实发病机理研究提供理论依据,对香梨果实采后病害防治及提高市售果实品质具有现实意义和指导作用,对库尔勒香梨产业发展有很好的推动作用。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.7;O433
【图文】：

示意图,拉曼散射,瑞利散射,示意图

病害的检测[79-81]。王斌等[82]研究利用 HSI 技术对腐烂、病害及正常梨枣进行分类，其分类准确率达到 99.12%。孙海霞等[83]基于 HSI 和卷积神经网络对鲜枣黑斑病检测，其模型的判别正确率在 90.0%以上。另外，HSI 技术还应用于桃子[84-86]、苹果[87-89]等多种果实病害的检测。1.3 拉曼光谱技术概论单色光和物质分子之间相互作用包括吸收、散射、光致发光和荧光等多种形式。其中，光子与物质分子相互作用的散射作用可分为弹性散射和非弹性散射两种。弹性散射只改变入射光子的方向，没有能量损失，也叫瑞利散射；非弹性散射不仅改变入射光子的方向，同时还改变光子的能量，使得光子的频率升高或降低。其中，光子能量减少的叫做斯托克斯散射，而能量增大的叫做反斯托克斯散射，非弹性散射中的斯托克斯散射和反斯托克斯散射统称为拉曼散射。拉曼散射现象是 1928 年由科学家 Raman 发现的[90]瑞利散射和拉曼散射的产生如图 1-2 所示。

技术路线图

【参考文献】