单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望（特邀综述）
发布时间：2021-02-08 17:23
随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.
【文章来源】：光子学报. 2020,49(09)北大核心
【文章页数】：18 页
【部分图文】：
荧光蛋白的几种光开关机制示意图
单分子定位技术使用特定的荧光分子探针标记样品，通过改变分子所处的外部环境有效控制其光开关特性，将空间上重叠的多分子荧光图像在时间上分离为一系列子图像，使得每一帧子图像中只有少量稀疏分布的单分子发射荧光，即每个衍射极限范围内只有一个荧光分子被激发．采集成千上万帧荧光信号随机分布的图像，利用单分子定位算法精确定位每个分子的中心位置．最后，将所有获得的定位点进行叠加，重建出一幅突破衍射极限的超分辨图像，原理如图2所示．假设探测到的单个荧光分子所发射的光子数为N，定位该分子视为对其位置进行了N次测量，每次测量的不确定性由系统的PSF尺寸决定．一般系统PSF近似呈高斯分布，对应的高斯函数标准差s与PSF尺寸FWHM满足关系定位精度由公式来估算，对应分辨率由此可见，SMLM的定位精度与系统PSF尺寸成正比，与单个荧光分子所发射的光子数成反比．早在1995年[41],BETZIG E就提出了利用单分子定位技术提高空间分辨率的概念，并于2006年[26]基于该理论首次开发出了利用光激活荧光蛋白的光开关特性实现超分辨的PALM技术，基本原理如图3所示．利用光激活绿色荧光蛋白（PA-GFP）标记样品，此类荧光蛋白在未被激活前，激发时不发荧光或发微弱荧光．加载样品后，采用405nm激活光以低能量脉冲方式照射目标区域，从而激活稀疏分布的少量荧光分子，之后切换561nm激发光连续照射，此时只有那些之前被激活的荧光分子发射荧光，即处于ON态（图3B,D），而其它未被激活的分子则处于不发光的OFF态，采集并定位这些单分子位置，直至这些发光分子被漂白，在下一次循环中不会再被激活（图3A,C）．多次重复该“激活-激发-定位-漂白”过程，最终将所有定位点叠加后重构出目标结构的超分辨图像（图3E′，F′）．
庄小威等[27]提出的基于单分子定位的STORM技术，其原理（如图4所示）与PALM十分相似，主要区别在于所使用的荧光分子探针不同．STORM使用光转换荧光染料（Cy3-Cy5分子对）标记样品，通过交替使用633nm的红光和532nm的绿光实现荧光分子Cy5的ON-OFF态转换，具体过程如图4(a）所示．首先利用高强度633nm红光持续照射样品，在此过程中Cy5分子被激发至ON态并迅速变为OFF态，此时利用低强度532nm绿光照射，使少部分随机分布的Cy5分子恢复至ON态，然后切换633nm红光照射，使得这些Cy5分子发射荧光并转换为OFF态，采集并定位这些单分子信号，不断重复该过程直至大部分荧光分子被漂白．在此过程中，激活分子Cy3可以加速荧光分子Cy5从OFF态到ON态转换的响应时间．图4 STORM的基本原理[27]
【参考文献】：
期刊论文
[1]超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展[J]. 胡春光,查日东,凌秋雨,何程智,李奇峰,胡晓东,胡小唐. 红外与激光工程. 2017(11)
[2]多色单分子定位超分辨显微成像术[J]. 潘雷霆,胡芬,张心正,许京军. 光学学报. 2017(03)
[3]运用结构光照明的活细胞超高分辨率成像技术[J]. 陈良怡. 中国科学:生命科学. 2015(09)
[4]高分辨和超分辨光学成像技术在空间和生物中的应用[J]. 姚保利,雷铭,薛彬,郜鹏,严绍辉,赵惠,赵卫,杨建峰,樊学武,邱跃洪,高伟,赵葆常,李英才. 光子学报. 2011(11)
[5]超分辨成像中荧光分子定位算法性能比较[J]. 全廷伟,曾绍群,吕晓华. 中国激光. 2010(11)
[6]超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限[J]. 毛峥乐,王琛,程亚. 中国激光. 2008(09)
本文编号：3024278
【文章来源】：光子学报. 2020,49(09)北大核心
【文章页数】：18 页
【部分图文】：
荧光蛋白的几种光开关机制示意图
单分子定位技术使用特定的荧光分子探针标记样品，通过改变分子所处的外部环境有效控制其光开关特性，将空间上重叠的多分子荧光图像在时间上分离为一系列子图像，使得每一帧子图像中只有少量稀疏分布的单分子发射荧光，即每个衍射极限范围内只有一个荧光分子被激发．采集成千上万帧荧光信号随机分布的图像，利用单分子定位算法精确定位每个分子的中心位置．最后，将所有获得的定位点进行叠加，重建出一幅突破衍射极限的超分辨图像，原理如图2所示．假设探测到的单个荧光分子所发射的光子数为N，定位该分子视为对其位置进行了N次测量，每次测量的不确定性由系统的PSF尺寸决定．一般系统PSF近似呈高斯分布，对应的高斯函数标准差s与PSF尺寸FWHM满足关系定位精度由公式来估算，对应分辨率由此可见，SMLM的定位精度与系统PSF尺寸成正比，与单个荧光分子所发射的光子数成反比．早在1995年[41],BETZIG E就提出了利用单分子定位技术提高空间分辨率的概念，并于2006年[26]基于该理论首次开发出了利用光激活荧光蛋白的光开关特性实现超分辨的PALM技术，基本原理如图3所示．利用光激活绿色荧光蛋白（PA-GFP）标记样品，此类荧光蛋白在未被激活前，激发时不发荧光或发微弱荧光．加载样品后，采用405nm激活光以低能量脉冲方式照射目标区域，从而激活稀疏分布的少量荧光分子，之后切换561nm激发光连续照射，此时只有那些之前被激活的荧光分子发射荧光，即处于ON态（图3B,D），而其它未被激活的分子则处于不发光的OFF态，采集并定位这些单分子位置，直至这些发光分子被漂白，在下一次循环中不会再被激活（图3A,C）．多次重复该“激活-激发-定位-漂白”过程，最终将所有定位点叠加后重构出目标结构的超分辨图像（图3E′，F′）．
庄小威等[27]提出的基于单分子定位的STORM技术，其原理（如图4所示）与PALM十分相似，主要区别在于所使用的荧光分子探针不同．STORM使用光转换荧光染料（Cy3-Cy5分子对）标记样品，通过交替使用633nm的红光和532nm的绿光实现荧光分子Cy5的ON-OFF态转换，具体过程如图4(a）所示．首先利用高强度633nm红光持续照射样品，在此过程中Cy5分子被激发至ON态并迅速变为OFF态，此时利用低强度532nm绿光照射，使少部分随机分布的Cy5分子恢复至ON态，然后切换633nm红光照射，使得这些Cy5分子发射荧光并转换为OFF态，采集并定位这些单分子信号，不断重复该过程直至大部分荧光分子被漂白．在此过程中，激活分子Cy3可以加速荧光分子Cy5从OFF态到ON态转换的响应时间．图4 STORM的基本原理[27]
【参考文献】：
期刊论文
[1]超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展[J]. 胡春光,查日东,凌秋雨,何程智,李奇峰,胡晓东,胡小唐. 红外与激光工程. 2017(11)
[2]多色单分子定位超分辨显微成像术[J]. 潘雷霆,胡芬,张心正,许京军. 光学学报. 2017(03)
[3]运用结构光照明的活细胞超高分辨率成像技术[J]. 陈良怡. 中国科学:生命科学. 2015(09)
[4]高分辨和超分辨光学成像技术在空间和生物中的应用[J]. 姚保利,雷铭,薛彬,郜鹏,严绍辉,赵惠,赵卫,杨建峰,樊学武,邱跃洪,高伟,赵葆常,李英才. 光子学报. 2011(11)
[5]超分辨成像中荧光分子定位算法性能比较[J]. 全廷伟,曾绍群,吕晓华. 中国激光. 2010(11)
[6]超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限[J]. 毛峥乐,王琛,程亚. 中国激光. 2008(09)
本文编号：3024278
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