钝齿棒杆菌中生物传感器ARG-ON的构建及在高产精氨酸菌株筛选中的应用
发布时间：2022-01-15 10:22
近年来,利用生物传感器对诱变菌株进行高通量筛选成为了获得高产菌株的一种有效方式。论文以钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）SYPA5-5为基础,构建了生物传感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）。通过对含有该生物传感器的钝齿棒杆菌菌株进行诱变,然后利用该生物传感器对诱变菌株进行高通量筛选,最终获得了精氨酸高产诱变菌株,提高了菌株的精氨酸产量。主要研究结果如下:（1）分别以sacB和gfp基因为报告基因,构建了生物传感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）。将启动子PargC分别与基因sacB和gfp进行串联,然后连接到载体pDXW-10中,构建出重组质粒PC-sacB-10和PC-gfp-10。随后将argR基因连接到重组质粒中,从而构建出生物传感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）。（2）验证在生物传感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）中,菌株的荧光强度和细胞生长状况与精氨酸产量之间的关系。分别在培养基中加入0,20,40,60,80,100 mmol·L-1的精氨酸,然后对含有生物传感器ARG-sac...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
生物传感器原理示意图
毒代谢中间产物的毒害作用，平衡代谢流，显著减弱细胞异源代谢途径的不适应性[3]。Zhang[23]等在大肠杆菌中利用转录因子FadR构建了能够响应脂肪酸的生物传感器，从而协调脂肪酸代谢通路中酰基CoA和乙醇的生物合成。在酰基CoA积累后，阻遏物FadR与其靶启动子解离，使乙醇的生物合成得到激活。在腊酯合酶的作用下，乙醇和酰基CoA结合转化为脂肪酸乙酯（FAEE）。通过生物传感器FadR的构建，成功抑制了乙醇和脂酰CoA代谢前体物质对于生长的毒害作用和抑制作用，避免了乙醇的过量积累，平衡了代谢流，维持了细胞的正常代谢活动。图1-2生物传感器的分类和应用Fig.1-2Classificationandapplicationofthebiosensor（A）生物传感器的分类（B）生物传感器的应用
第一章绪论7作用、过表达精氨酸操纵子、优化磷酸戊糖途径的NADPH供应、减少副产物的形成、增加精氨酸合成途径的碳通量、增加葡萄糖的消耗量等一系列代谢工程技术，最终构建了一株精氨酸高产菌株，5L发酵罐产量可达87.3g·L-1。2017年，Guo[53]等在钝齿棒杆菌SDNN403中提高了氮供应和氨同化水平，通过在发酵过程中添加氮原子供体（L-谷氨酸、L-天冬氨酸），并过表达其中的glnA、aspA和gdh基因，最终菌株的5L发酵罐产量为53.2g·L-1，较其出发菌株提高了41.5%。2019年，阚宝军，董晋军[54]等在谷氨酸棒状杆菌SNK118中表达了3-磷酸甘油醛脱氢酶，该酶为NADP+依赖型，最终使得细胞内的NADPH水平得到了提高，摇瓶发酵可产L-精氨酸11.6g·L-1。图1-3钝齿棒杆菌中L-精氨酸合成代谢工程改造示意图[39]Fig.1-3MethodsofmetabolicengineeringforL-argininesynthesisinC.crenatum[39]1.5报告基因研究概述1.5.1绿色荧光蛋白gfp绿色荧光蛋白gfp（greenfluorescentprotein）是1962年由Shimomure[55]等在多管水母中发现的，当其被蓝光或紫外光激发后，能够发出绿色荧光。1994年，Chalfie[56]等首次在大肠杆菌中表达了绿色荧光蛋白，使得之后gfp被更加广泛地研究和应用。绿色荧光蛋白gfp在多种生物体内均能够成功表达并发出荧光，在与靶基因融合后，它不会影响靶基因的功能，而且其荧光的表达不会对细胞造成毒性[57]。此外，绿色荧光蛋白gfp的检测方法十分简单方便，利用荧光显微镜、流式细胞仪等仪器均能够对细胞进行检测。基于这些优点，绿色荧光蛋白gfp成为了一直以来用于反映细胞内基因转录水平及对蛋白进行
【参考文献】：
期刊论文
[1]3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸[J]. 阚宝军,董晋军,刘晖,占米林,许国超,韩瑞枝,倪晔. 食品与发酵工业. 2019(15)
[2]高通量筛选技术在菌种进化中的研究进展[J]. 杨祖明,王颖,姚明东,肖文海. 化工进展. 2019(05)
[3]代谢物生物传感器:微生物细胞工厂构建中的合成生物学工具[J]. 周益康,吴亦楠,王天民,郑翔,邢新会,张翀. 生物技术通报. 2017(01)
[4]生物传感器在代谢工程中的应用[J]. 张楠楠,王金保,董润安,高海军. 生命科学仪器. 2016(03)
[5]L-精氨酸生物合成机制及其代谢工程育种研究进展[J]. 程功,徐建中,张伟国. 微生物学通报. 2016(06)
[6]绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用[J]. 吴沛桥,巴晓革,胡海,赵静. 生物医学工程研究. 2009(01)
[7]血管内皮生长因子和L-精氨酸联合作用于大鼠缺血皮瓣的实验研究[J]. 闵定宏,张福庆,李国辉. 中国微循环. 2008(05)
[8]L-精氨酸生产菌株FHA0055的选育研究[J]. 贺小贤,付四清,杜永呢,孙莹,赵少欣. 陕西科技大学学报. 2007(03)
[9]用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选有效的siRNA[J]. 单志新,林秋雄,符永恒,邓春玉,李晓红,余细勇. 中国生物化学与分子生物学报. 2007(03)
[10]L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制[J]. 许正宏,熊筱晶,窦文芳,陶文沂. 工业微生物. 2006(04)
硕士论文
[1]构建表达蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白融合基因研究蓖麻毒素A链的细胞内转运途径[D]. 刘琼.浙江大学 2006
本文编号：3590451
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
生物传感器原理示意图
毒代谢中间产物的毒害作用，平衡代谢流，显著减弱细胞异源代谢途径的不适应性[3]。Zhang[23]等在大肠杆菌中利用转录因子FadR构建了能够响应脂肪酸的生物传感器，从而协调脂肪酸代谢通路中酰基CoA和乙醇的生物合成。在酰基CoA积累后，阻遏物FadR与其靶启动子解离，使乙醇的生物合成得到激活。在腊酯合酶的作用下，乙醇和酰基CoA结合转化为脂肪酸乙酯（FAEE）。通过生物传感器FadR的构建，成功抑制了乙醇和脂酰CoA代谢前体物质对于生长的毒害作用和抑制作用，避免了乙醇的过量积累，平衡了代谢流，维持了细胞的正常代谢活动。图1-2生物传感器的分类和应用Fig.1-2Classificationandapplicationofthebiosensor（A）生物传感器的分类（B）生物传感器的应用
第一章绪论7作用、过表达精氨酸操纵子、优化磷酸戊糖途径的NADPH供应、减少副产物的形成、增加精氨酸合成途径的碳通量、增加葡萄糖的消耗量等一系列代谢工程技术，最终构建了一株精氨酸高产菌株，5L发酵罐产量可达87.3g·L-1。2017年，Guo[53]等在钝齿棒杆菌SDNN403中提高了氮供应和氨同化水平，通过在发酵过程中添加氮原子供体（L-谷氨酸、L-天冬氨酸），并过表达其中的glnA、aspA和gdh基因，最终菌株的5L发酵罐产量为53.2g·L-1，较其出发菌株提高了41.5%。2019年，阚宝军，董晋军[54]等在谷氨酸棒状杆菌SNK118中表达了3-磷酸甘油醛脱氢酶，该酶为NADP+依赖型，最终使得细胞内的NADPH水平得到了提高，摇瓶发酵可产L-精氨酸11.6g·L-1。图1-3钝齿棒杆菌中L-精氨酸合成代谢工程改造示意图[39]Fig.1-3MethodsofmetabolicengineeringforL-argininesynthesisinC.crenatum[39]1.5报告基因研究概述1.5.1绿色荧光蛋白gfp绿色荧光蛋白gfp（greenfluorescentprotein）是1962年由Shimomure[55]等在多管水母中发现的，当其被蓝光或紫外光激发后，能够发出绿色荧光。1994年，Chalfie[56]等首次在大肠杆菌中表达了绿色荧光蛋白，使得之后gfp被更加广泛地研究和应用。绿色荧光蛋白gfp在多种生物体内均能够成功表达并发出荧光，在与靶基因融合后，它不会影响靶基因的功能，而且其荧光的表达不会对细胞造成毒性[57]。此外，绿色荧光蛋白gfp的检测方法十分简单方便，利用荧光显微镜、流式细胞仪等仪器均能够对细胞进行检测。基于这些优点，绿色荧光蛋白gfp成为了一直以来用于反映细胞内基因转录水平及对蛋白进行
【参考文献】：
期刊论文
[1]3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸[J]. 阚宝军,董晋军,刘晖,占米林,许国超,韩瑞枝,倪晔. 食品与发酵工业. 2019(15)
[2]高通量筛选技术在菌种进化中的研究进展[J]. 杨祖明,王颖,姚明东,肖文海. 化工进展. 2019(05)
[3]代谢物生物传感器:微生物细胞工厂构建中的合成生物学工具[J]. 周益康,吴亦楠,王天民,郑翔,邢新会,张翀. 生物技术通报. 2017(01)
[4]生物传感器在代谢工程中的应用[J]. 张楠楠,王金保,董润安,高海军. 生命科学仪器. 2016(03)
[5]L-精氨酸生物合成机制及其代谢工程育种研究进展[J]. 程功,徐建中,张伟国. 微生物学通报. 2016(06)
[6]绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用[J]. 吴沛桥,巴晓革,胡海,赵静. 生物医学工程研究. 2009(01)
[7]血管内皮生长因子和L-精氨酸联合作用于大鼠缺血皮瓣的实验研究[J]. 闵定宏,张福庆,李国辉. 中国微循环. 2008(05)
[8]L-精氨酸生产菌株FHA0055的选育研究[J]. 贺小贤,付四清,杜永呢,孙莹,赵少欣. 陕西科技大学学报. 2007(03)
[9]用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选有效的siRNA[J]. 单志新,林秋雄,符永恒,邓春玉,李晓红,余细勇. 中国生物化学与分子生物学报. 2007(03)
[10]L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制[J]. 许正宏,熊筱晶,窦文芳,陶文沂. 工业微生物. 2006(04)
硕士论文
[1]构建表达蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白融合基因研究蓖麻毒素A链的细胞内转运途径[D]. 刘琼.浙江大学 2006
本文编号：3590451
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