基于G-四链体及其荧光探针构建的UDG生物传感器

发布时间：2017-05-25 21:08

  本文关键词：基于G-四链体及其荧光探针构建的UDG生物传感器，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA Glycosylase, UDG)是一种高度保守的修复蛋白,它通过移除DNA中错误出现的尿嘧啶碱基来防止DNA中的基因错配或突变,保持基因的完整性。因此,对该酶的活性检测有重要意义。但是传统的UDG活性检测方法繁琐耗时,存在污染风险,因此急需开发新型的检测手段,如核酸生物传感器,实现对UDG的快速检测。G-四链体DNA是一种富含鸟嘌呤(G)的核酸二级结构。基于G-四链体构建的荧光核酸生物传感器在生化分析与诊断等领域有广泛的应用。本论文,针对G-四链体二级结构的对称性,设计合成了C1-,C2-,C3-对称的芳香乙烯取代吡啶衍生物作为G-四链体荧光探针,并筛选出最优荧光探针与G-四链体共同构建UDG生物传感器。本论文主要内容及结果包括：1)设计合成新型荧光探针。针对G-四链体DNA的结构对称性,设计了一系列C1-、 C2-、C3-对称的芳香乙烯取代吡啶衍生物,并以简单的合成步骤得到了三个系列C1-(单取代1个)、C2-(双取代2个)、C3-(三取代2个)共5个有对称规律的衍生物。2)评价与筛选最优荧光探针。通过荧光滴定,PAGE实验、CD光谱、紫外滴定、FRET熔点实验等手段考察了衍生物对G-四链体的选择性、最低检测限及其相互作用模式。该衍生物在不同类型的核酸中优先结合了G-四链体,更重要的是,取代基的数目、种类以及衍生物的对称性对其与G-四链体的荧光响应的影响显著。其中,双吲哚基取代C2-对称衍生物2a对G-四链体DNA有最佳的选择性和灵敏度(K=2.17×105M-1, LOD= 33nM),并在细胞荧光成像实验中显示出优良的性能。3)构建与评价UDG生物传感器。传感器中含有G-四链体DNA (ON1)和含尿嘧啶的DNA链(ON2)组成的双链DNA, UDG酶作用于该双链后,释放出ON1,进而形成G-四链体,与2a特异性作用后产生显著的荧光信号。该传感器的检测线性范围：0.05-1.00 U/mL,检测限：0.005 U/mL。此外,在胎牛血清样品中的UDG回收率为75.05%-102.7%,并能应用于UDG抑制剂的筛选。
【关键词】：尿嘧啶DNA糖苷化酶 生物传感器 G-四链体 荧光探针
【学位授予单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;TP212
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstrate5-13
• 第一章 绪论13-31
• 1.1 尿嘧啶DNA糖苷酶简介13-19
• 1.1.1 尿嘧啶DNA糖苷酶家族Ⅰ(UDG)16-17
• 1.1.2 UDG的功能17-18
• 1.1.3 UDG活性的测试18-19
• 1.2 基于核酸二级结构构建的酶检测的生物传感器19-24
• 1.2.1 生物传感器19-20
• 1.2.2 光学生物传感器20-21
• 1.2.3 核酸生物传感器21
• 1.2.4 荧光核酸生物传感器21-24
• 1.3 G-四链体/荧光探针构建的UDG生物传感器24-29
• 1.3.1 G-四链体简介24-25
• 1.3.2 小分子荧光探针与G-四链体DNA作用的研究方法25-28
• 1.3.3 G-四链体/荧光探针构建的UDG生物传感器28-29
• 1.4 本论文的研究构想29-31
• 第二章 吡啶苯乙烯衍生物的设计合成及表征31-37
• 2.1 引言31
• 2.2 吡啶苯乙烯衍生物的设计思路31-32
• 2.3 苯乙烯取代吡啶衍生物的合成路线32-33
• 2.4 结果与讨论33-34
• 2.5 实验部分34-37
• 2.5.1 实验试剂及仪器34
• 2.5.2 实验步骤34-37
• 第三章 衍生物作为G-四链体DNA荧光探针的性能研究37-54
• 3.1 引言37-38
• 3.2 衍生物的光谱学性质研究38
• 3.3 G-四链体荧光探针的筛选38-44
• 3.3.1 衍生物对G-四链体DNA的荧光响应38-41
• 3.3.2 衍生物的荧光量子产率测试41-42
• 3.3.3 衍生物对telo21的结合常数的测试42-43
• 3.3.4 衍生物对telo21 DNA的检出限的测试43-44
• 3.4 2a与G-四链体的相互作用及细胞成像44-48
• 3.4.1 2a对不同DNA结构的选择性45
• 3.4.2 2a与G-四链体结合的CD光谱实验45
• 3.4.3 2a对G-四链体的稳定作用45-46
• 3.4.4 2a的PAGE染色实验和细胞成像46-48
• 3.5 本章小结48-49
• 3.6 实验部分49-54
• 3.6.1 实验试剂及仪器49-50
• 3.6.2 实验方法及步骤50-54
• 第四章 基于G-四链体/荧光探针的UDG生物传感器54-64
• 4.1 前言54
• 4.2 UDG传感器的设计原理54-55
• 4.3 结果与讨论55-61
• 4.3.1 可行性实验55
• 4.3.2 对照实验55-57
• 4.3.3 关于该体系实验结果的验证性实验57-59
• 4.3.4 该检测体系对UDG的选择性考察59-60
• 4.3.5 在真实样品中的UDG检测60-61
• 4.4 本章小结61
• 4.5 实验步骤61-64
• 4.5.1 实验仪器与试剂61-62
• 4.5.2 实验方法62-64
• 结论与展望64-66
• 参考文献66-75
• 化合物编号与结构75-76
• 附录76-86
• 攻读硕士研究生期间发表的论文86-88
• 致谢88

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